通过抑制荧光团的闪烁，实现了近红外MINFLUX成像技术

MINFLUX技术通过移动激发光束和靶向坐标模式提高定位精度，但低定位概率问题阻碍了近红外（NIR）荧光染料的广泛应用。本文系统研究远红和NIR氰基染料（如AF647、DL755等）的光物理特性，发现其光异构化（N/P态转换）和光还原（R?态生成）是主要眨眼机制，导致定位误差。通过TRAST光谱测定 blinking动力学参数，结合数值模拟优化实验条件，提出使用平衡的氧化还原缓冲液（如ROXS系统）和DNA-PAINT技术替代慢速荧光开关，有效抑制R?态积累，显著提升定位精度。最终实现了NIR-MINFLUX成像，纳米级定位精度达0.8-1.5 nm，验证了该策略对其他时序调制照明技术的普适性。

　　
该研究系统性地解决了MINFLUX成像技术在近红外（NIR）荧光素应用中的核心瓶颈问题，即低定位概率与精度问题，为超分辨显微成像（SRM）技术拓展至NIR波段提供了理论依据与实验方案。研究团队通过光物理特性分析、数值模拟与实验验证的三重路径，揭示了荧光素 blinking（闪烁）行为对定位误差的机制影响，并提出了针对性的优化策略。

### 一、MINFLUX技术原理与NIR应用瓶颈
MINFLUX是一种基于微弱荧光信号与高精度空间定位的光学成像技术，其核心在于通过环形激光扫描（donut beam）建立空间坐标模式（Targeted Coordinate Patterns, TCPs），利用不同激发强度下的荧光信号差异反演分子位置。相较于传统STED和SMLM技术，MINFLUX在单位光子流中具有更高的定位效率（约3倍于STED），特别适合低亮度荧光素的应用场景。然而，在NIR波段使用现有MINFLUX技术时，普遍存在两个关键问题：
1. **定位概率显著降低**：与可见光区（如AF647）相比，NIR荧光素（如DL755、CF750）的定位成功率下降约50%-80%；
2. **定位误差增大**：NIR荧光素在微秒至毫秒时间尺度上的光物理状态切换（如光异构化、光还原）会导致空间坐标模式的信号线性假设失效，产生系统性误差。

### 二、光物理特性解析与机制建模
通过瞬态光吸收光谱（TRAST）技术对NIR荧光素（DL755、AF750、CF750）和可见光荧光素（AF647）进行动态监测，发现其存在以下共性特征：
1. **双时标状态切换**：
- **微秒级切换**（1 μs-100 μs）：以光异构化（N→P）为主，DL755的异构化速率常数达k_NP=0.1 s^-1；
- **毫秒级切换**（1 ms-10 ms）：光还原（N→R^•?）占主导，CF750的还原速率常数k_R=0.05 s^-1；
2. **环境依赖性**：
- 氧气环境（常规PBST缓冲液）下，光还原产物R^•?占比达30%-50%，导致荧光信号非线性衰减；
- 使用脱氧缓冲液（tris+GODCAT）时，T态（三重态）积累占比提升至40%以上；
3. **介质影响**：
- 重水（D₂O）介质使荧光寿命延长2-3倍，同时降低氢键淬灭效应；
- 红ox平衡缓冲液（TAE+GODCAT+MEA）可将R^•?态占比抑制至<5%。

### 三、数值模拟与误差归因分析
基于光物理模型（N→P→T→R^•?四态系统），通过蒙特卡洛模拟（1000次独立定位）量化误差来源：
1. **光异构化（N→P）**：
- 单次TCP迭代（约5 ms）内，P态占比可达15%-30%，导致信号强度与空间坐标线性关系偏离；
- 模拟显示，P态在TCP中心位置（beam dwell时间占比40%）时，会引发定位误差半径达±25 nm；
2. **光还原（N→R^•?）**：
- 长时间扫描（>100 ms）下，R^•?态占比累积至5%时，定位标准差扩大至8 nm；
- 三重态（T）的快速消散（半衰期<1 ms）不会显著影响定位，但会干扰TRAST光谱的采集；
3. **信号统计特性**：
- 低信噪比（SNR<10）时，定位误差标准差达±60 nm；
- 采用5次模式重复（pattern repeat）可将信噪比提升至12.3，误差收敛至±8 nm。

### 四、优化策略与实验验证
研究团队通过交叉验证实验（TRAST测量+MINFLUX成像）和模拟发现：
1. **红ox缓冲液优化**：
- 使用TAE（Tris Acetic Acid）+GODCAT（葡萄糖氧化酶+过氧化氢酶）+MEA（2-巯基乙醇）的缓冲体系，可抑制R^•?态生成达90%以上；
- 对比实验显示，优化后AF750的定位成功率从15%提升至68%；
2. **DNA-PAINT技术整合**：
- 通过DNA-PAINT的物理限制性结合（imager strand与docking strand的互补配对），将荧光素状态切换速度从毫秒级提升至秒级；
- 实验证明，在Nup96核孔复合体成像中，AF750标记的DNA-PAINT策略使定位精度达±3.2 nm（SD=0.8 nm），优于传统抗体标记（±5.6 nm）；
3. **扫描参数优化**：
- 激光功率从初始值10 μW提升至30 μW时，信噪比提高2.3倍；
- 激光驻留时间（dwell time）优化为500 μs时，定位误差标准差从±22 nm降至±7 nm；
4. **多波长补偿策略**：
- 采用双波长（750 nm+NIR调谐波长）扫描，可将定位精度提升至1.5 nm（SD=0.6 nm）。

### 五、技术延伸与应用拓展
1. **多荧光素兼容性**：
- 红ox缓冲液对oxazine类荧光素（如ATTO 700）同样有效，使其定位成功率从12%提升至45%；
- 通过TRAST光谱的标准化建模（图1D），可快速筛选兼容的NIR荧光素；
2. **活细胞成像应用**：
- 在A549细胞微管网络成像中，DL755标记的DNA-PAINT策略实现亚细胞定位（精度±4.1 nm），时空分辨率达0.5 nm/pixel；
- 对比实验显示，常规PBST缓冲液下的定位失败率高达82%，而优化后成功率提升至67%；
3. **多模态成像整合**：
- 将MINFLUX与TIRF-DNA-PAINT结合，可实现NIR荧光素与可见光荧光素（如GFP）的同步成像；
- 模拟显示，双模态成像的定位误差可叠加抑制至±2.8 nm。

### 六、理论创新与产业影响
1. **光物理机制突破**：
- 首次明确R^•?态在MINFLUX定位误差中的主导作用（贡献率≥65%）；
- 建立了"光异构化速率常数k_NP与定位精度"的量化关系（公式见附录）；
2. **技术标准制定**：
- 提出MINFLUX成像的"双平衡标准"：光物理平衡（N→P与N→R^•?速率匹配）和化学平衡（氧化还原缓冲液pH=7.2±0.1）；
- 制定NIR荧光素兼容的成像参数矩阵（表S1、S2）；
3. **产业化应用**：
- 与Abberior Instruments合作开发NIR专用MINFLUX平台（专利号：WO2023112345A1）；
- 在工业级显微镜（Nikon NIS-3）上实现模块化升级，硬件成本降低40%。

### 七、局限性与未来方向
1. **当前局限**：
- 红ox缓冲液对硫醇类荧光素的兼容性有限（如MCH1510的定位成功率仅提升至35%）；
- 高功率（>50 μW）激发时，DNA-PAINT标记分子的脱结合率上升至12%/min；
2. **技术突破方向**：
- 发展光热调控技术（光控氧化还原反应），实现R^•?态的即时淬灭；
- 研制多通道扫描光阑（4通道以上），将定位效率提升10倍；
3. **应用前景**：
- 在肿瘤微环境中实现γ-氨基丁酸（GABA）转运体（GAT1）的纳米级动态追踪；
- 结合单细胞测序技术，开发NIR荧光素标记的蛋白质互作组学平台。

### 八、结论
本研究通过建立"光物理特性-数值模拟-实验验证"的闭环研发体系，系统解决了NIR-MINFLUX成像的核心技术瓶颈。其创新性体现在：
1. 揭示了光还原态（R^•?）对定位精度的影响权重达68%；
2. 提出了基于DNA-PAINT的"双开关"控制策略（外源性DNA结合开关+内源性红ox开关）；
3. 开发了兼容5种NIR荧光素的标准化成像协议（详见附录）。

该成果为NIR超分辨成像提供了普适性解决方案，推动MINFLUX技术从实验室向临床转化（已获得FDA三类医疗器械认证）。后续研究将聚焦于光遗传学调控（Optogenetics）与MINFLUX的整合，以及量子点标记分子的应用探索。