《Biochemical Engineering Journal》：Characterization of hydrogels made of a novel recombinant spider silk proteins MaNC and evaluation for drug carriers
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基于重组蜘蛛丝蛋白MaNC的快速水凝胶构建及其药物递送特性
王康康|王国庚|赵振洲|周旭杰|张恒瑞|李娜|鲍洪丹
中国科学院温州研究院医学联合研究中心，中国浙江省温州市325000
摘要
由于蜘蛛丝蛋白（spidroins）具有良好的生物相容性和低免疫原性，它们成为具有广泛应用潜力的生物聚合物。在这些材料中，基于spidroins的水凝胶因其无毒性和优异的机械性能而在生物材料研究中受到了广泛关注。然而，已报道的spidroin水凝胶的凝胶化时间较长。在本研究中，我们通过融合高度可溶的N端结构域和来自主要球状spidroin的自组装C端结构域，设计了一种新型重组spidroin（MaNC）。N端结构域赋予MaNC高溶解性，而C端结构域则使其具有自组装能力，从而实现了MaNC的快速凝胶化。我们证明，在37°C下，MaNC可以在10分钟内自发自组装成水凝胶，并形成β-折叠结构，无需任何外部添加剂。实验表明，这种自组装的MaNC水凝胶不会膨胀，可以在水环境中轻松装载多柔比星（DOX），并且药物释放速率可以通过改变蛋白质浓度和pH值来调节。总体而言，这些数据表明我们的蜘蛛丝水凝胶是一种快速凝胶化、高度适应性强的细胞相容性材料，适用于温和条件下的药物输送。
引言
蜘蛛丝由蜘蛛丝蛋白（spidroins）组成，是自然界中最坚韧的天然材料之一，在生物医学和组织工程领域具有广泛的应用前景[1]、[2]、[3]。圆网蜘蛛能够从不同的丝腺产生七种类型的丝纤维，这些丝纤维在形态上有所不同，分别用于特定任务[4]。其中，由主要球状丝腺合成的牵引丝具有很高的强度和韧性，主要由主要球状spidroin（MaSps）构成[5]。与其他spidroins一样，MaSp蛋白具有高度重复的核心结构域，两侧是非重复的N端（N-）和C端（C-）结构域[6]。MaSp蛋白的重复核心序列包含多个串联重复单元，其中包含聚丙氨酸、GA和富含甘氨酸的基序。聚丙氨酸基序形成紧密的β-折叠晶体，对牵引丝的强度至关重要，而富含甘氨酸的基序则折叠成β-转角结构，赋予丝纤维弹性[7]。由于大多数蜘蛛具有同类相食的行为，通过养殖蜘蛛大规模生产蜘蛛丝纤维是不可行的。然而，重组蜘蛛丝的生产和纯化技术的快速发展为基于spidroins的材料提供了新的机会[8]。在过去十年中，几种基于牵引丝序列的重组spidroins已在大肠杆菌中制备出来，并可以组装成多种形式，具有生物相容性、低免疫原性和非细胞毒性，包括纤维、薄膜、颗粒和水凝胶[9]、[10]、[11]、[12]。其中，水凝胶是一种三维聚合物网络，能够吸收水分，其含水量可超过95%[13]。通过调整蛋白质浓度、pH值和离子浓度，可以控制基于spidroins的水凝胶的性质[14]。此外，蜘蛛丝水凝胶的生物相容性使它们成为生物医学应用（如药物载体）的理想材料。据我们所知，大多数用于组织工程和药物输送的重组蜘蛛丝蛋白都是基于牵引丝的核心序列[15]、[16]。然而，由于这些重组spidroins的核心序列富含腺嘌呤和胞嘧啶，导致其凝胶化速率慢且产量低，从而降低了重组蛋白的表达水平。最近的研究表明，通过对spidroin重复结构域的非晶区域进行极性酸碱修饰，可以部分提高其表达水平[17]。与负责丝纤维机械性能的核心重复结构域不同，末端结构域在储存高浓度spidroins和形成丝纤维过程中起着关键作用[6]。最近，从圆网蜘蛛Araneus ventricosus中鉴定出了一种MaSp1的次要异构体（MaSp1-1），扩展了MaSp1的蛋白质产物列表[18]。MaSp1-1由267个氨基酸组成，主要由N端（NT）和C端（CT）结构域构成。尽管缺乏核心结构域，MaSp1-1仍能成功自组装成具有良好机械性能的纤维。此外，仅包含末端序列的重组蜘蛛丝蛋白NC在剪切力作用下也能形成丝纤维[19]。考虑到末端结构域的自组装能力，探索基于重组NT-CT融合蛋白的新型蜘蛛丝水凝胶对于实现更快的凝胶化过程至关重要。
在本研究中，我们成功制备了仅由MaSp1末端结构域组成的重组蜘蛛丝蛋白MaNC，并制备了MaNC水凝胶，探讨了其作为药物释放系统的潜力。我们对所得水凝胶的形态、结构和流变性能进行了表征。此外，我们还研究了MaNC水凝胶在输送多柔比星（DOX）方面的应用，DOX是癌症化疗中最常用的药物之一。同时，我们评估了载有DOX的MaNC水凝胶在癌症治疗中的性能，并将其与游离DOX进行了比较。
节选内容
重组质粒的构建
MaNC构建体包含了来自A. ventricosus MaSp1的N端和C端结构域。此外，还从A. ventricosus的基因组DNA中克隆了分别包含MaSp1 N端或C端结构域的NT和CT构建体。NT构建体使用引物NF（5'- GGT CAG TCA CCA TGG CAA AAC-3'）和NR1（5'- GAC ACG GCA TTT GCC TGA GCA AAC-3'），而CT构建体使用引物CF（5'- TCA GCA TCA TCT GCT GCT GC-3'）和CR（5'- AGA AAG AGC TTG GTA AAC AGA C-3'）
MaNC的制备及MaNC水凝胶的形成
先前的研究表明，源自MaSp核心结构的重组蜘蛛丝蛋白可以自组装成水凝胶，这为组织工程应用提供了有前景的候选材料[21]、[22]、[23]。在本研究中，成功制备了缺乏核心结构的重组蜘蛛丝蛋白（MaNC）（图1A）。结论
在本研究中，我们设计了一种新型重组蜘蛛丝蛋白MaNC。MaNC是通过结合MaSp1蛋白的末端序列构建的。这两个末端结构域在MaNC蛋白的凝胶化过程中发挥着不同的作用：N端结构域（NT）对维持MaNC的溶解性至关重要，从而实现了凝胶化所需的高蛋白浓度；而C端结构域（CT）则赋予其自组装能力。
CRediT作者贡献声明
周旭杰：正式分析、写作——审稿与编辑。王康康：写作——初稿撰写、监督、实验研究、正式分析、概念构思。王国庚：写作——审稿与编辑、实验研究、正式分析、概念构思。鲍洪丹：写作——审稿与编辑、监督、正式分析、概念构思。李娜：写作——审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。张恒瑞：正式分析。赵振洲：写作——审稿与利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国科学院温州研究院的启动资金（WIUCASQD2021043）和辽宁省教育厅的普通高等学校基本科学研究项目（LJKMZ20221174）的财政支持。
