面向工业生物精炼的β-葡聚糖酶工程：基于数据库的定向进化技术用于优化热稳定性

《Biomass and Bioenergy》：β-Glucanase engineering oriented to industrial biorefinery: Database-based directed evolution for thermostability optimization

本研究从NCBI数据库筛选获得新型β-葡萄糖苷酶PcGlu16B，通过异源表达和定向进化优化其热稳定性和催化效率，突变体M1（N11Y/S209Q）在50℃下半衰期延长157分钟，催化效率提升1.29倍，结合结构分析和协同催化应用，显著提高了玉米芯降解效率，为工业生物精炼提供了高效候选酶。

　　

Xiao-Lu Zhu|Shu-Biao Yuan|Jing Li|Marriam Khurshid|Richard Ansah Herman|Jie Qi|Hong-Yu Guo|Wei-Guo Zhao|Jun Wang|Shuai You

江苏省科学技术大学生物技术学院蚕桑生物技术与生物学重点实验室，中国江苏省镇江市212100

摘要

β-葡聚糖酶在生物质转化过程中被广泛使用。然而，它们在工业高温下的催化性能不足，限制了其在生物精炼中的应用。在这项研究中，通过蛋白质数据库筛选从Polychaeton citri中鉴定出一种高活性的1,3-1,4-β-葡聚糖酶（PcGlu16B），并进行了异源表达。为了优化其热稳定性，采用了定向进化技术，最终筛选出三种有益的突变体（N11Y、S209Q和G228P）。最优组合突变体N11Y/S209Q（M1）与野生型（WT）相比表现出显著改善的性能：在50°C下的热半衰期延长了157分钟，催化效率提高了1.29倍（从3100 mL s^?1 mg^?1提高到4000 mL s^?1 mg^?1），并且对蛋白酶和化学试剂的抵抗力也得到了增强。结构分析表明，增加的氢键、盐桥和刚性二级结构元素赋予了更高的刚性和热稳定性。同时，增强的长程负相互作用调节了催化通道内的关键残基，提高了催化效率。M1与木聚糖酶在碱性预处理条件下协同作用时，表现出最佳的玉米芯降解效果，可产生5.7 mmol/g的可发酵糖，最大协同度为2.1。这些结果表明，基于数据库设计的突变体M1是一种具有热稳定性的理想候选酶，适用于工业生物质转化，并为生物精炼中的酶工程提供了战略框架。

引言

来自植物材料的木质纤维素多糖被全球公认为一种成本效益高且可持续的可再生能源[1,2]。β-葡聚糖是非结构性的淀粉多糖，由通过β-1,3和/或β-1,4糖苷键连接的β-D-糖基单元组成[3]。它们广泛存在于谷物细胞的细胞壁中，是半纤维素的重要组成部分。在玉米芯中，β-葡聚糖含量占40%–55%，并与木聚糖形成广泛的交联，构成了生物质降解的主要障碍[4]。1,3-1,4-β-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）能够特异性地切割混合连接葡聚糖中的β-1,4糖苷键，是一种理想的生物催化剂[5]。然而，在生物质转化的工业过程中，所需的生物处理条件（如高温、极端pH值和金属离子干扰）会不可避免地抑制酶的活性[6]。例如，当温度达到50–70°C的工业处理范围时，大多数商业β-葡聚糖酶的热稳定性有限，在长时间反应后催化效率会显著下降，降至初始活性的20%以下。这大大降低了生产效率并增加了运营成本[7]。

合理设计和定向进化是常见的提高酶热稳定性的策略[8]。在以往的方法中，通过强化特定区域来提高热稳定性的合理设计策略往往会导致灵活性降低，从而影响底物亲和力[9,10]。例如，Wei等人[11]通过β因子分析结合在线软件预测热敏感位点，将葡聚糖酶AoDex在60°C下的半衰期（t_1/2）提高了4.4倍。然而，其比活性从最初的859 U/mg下降到了780 U/mg。同时，Chen等人[12]通过引入二硫键获得了葡聚糖酶突变体DexM2（D279C/S289C），其最佳使用温度提高了13°C，但催化效率下降了12.9%。此外，合理设计的实施依赖于已报道的蛋白质结构，这大大限制了材料的选择。然而，定向进化通过迭代突变和筛选解决了这些限制。像DNA随机化和易出错的PCR这样的技术仅凭原始基因序列就能生成多样的酶突变体，为平衡稳定性和功能性提供了更多可能性[13]。

在这项研究中，我们改造了Polychaeton citri 1,3-1,4-β-葡聚糖酶（PcGlu16B）的热稳定性和催化效率。这是一种新发现的β-葡聚糖酶，首次直接从NCBI蛋白质数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）中提取并表达。PcGlu16B基因在Pichia pastoris中异源表达，产生了一种能够有效催化大麦β-葡聚糖、地衣素和层藻聚糖的活性β-葡聚糖酶。然而，它的热稳定性有限。由于缺乏结构数据，我们使用易出错的PCR生成了一个突变体文库，并通过生化表征筛选出具有改进功能特性的突变体。结果，突变体M1（N11Y/S209Q）在热稳定性和催化效率方面都表现出显著改善。计算分析，包括同源建模、分子对接和动力学模拟，用于阐明突变驱动的分子稳定机制。此外，还研究了葡聚糖酶和木聚糖酶在生物质预处理中的协同应用，为工业应用中的可发酵糖生产提供了更有效的策略。通过结合酶工程、计算分析和工业验证，本研究为基于大规模数据库挖掘的分子优化提供了可行的参考，以满足特定的工业需求，并推动了高效生物质生物精炼的潜力。

菌株、质粒和化学品

Escherichia coli DMT和DH5α感受态细胞来自TransGen（北京，中国）。表达宿主Pichia pastoris GS115和质粒pPIC9购自Invitrogen（加利福尼亚州圣地亚哥）。DNA聚合酶（rTaq和FastPfu）、限制性内切酶（EcoRI、NotI和BglII）、T4 DNA连接酶和DNA标记物购自Tiangen（北京，中国）。DNA纯化试剂盒、dNTPs（包括dTTP和dCTP）和BCA蛋白测定试剂盒购自MBI Fermentas（渥太华，

基于数据库的PcGlu16B选择及其突变体的表达和筛选

为了挖掘潜在的β-葡聚糖酶作为研究材料，我们使用了目前报道的具有最高比活性（超过50,000 U/mg（针对大麦葡聚糖）的β-葡聚糖酶BisGlu16B_ΔC [26]的基因参考。这种优化的β-葡聚糖酶是我们团队之前通过去除Bispora sp. MEY-1 BisGlu16B（ACCESSION: KXL51537）的冗余C末端区域（127个氨基酸）获得的。具体来说，BisGlu16B_ΔC的氨基酸序列被应用

结论

本研究成功从NCBI蛋白质数据库中的Polychaeton citri CBS 116435基因信息表达了高活性的多功能GH16 1,3-1,4-β-葡聚糖酶（PcGlu16B）。尽管该葡聚糖酶的晶体结构尚未分析，但通过定向进化显著提高了其催化性能。主要突变体N11Y/S209Q在50°C下的半衰期延长了2小时，同时催化效率也有所提高

CRediT作者贡献声明

Xiao-Lu Zhu：撰写 – 原始草稿，数据管理。Shu-Biao Yuan：软件开发，数据管理。Jing Li：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。Marriam Khurshid：撰写 – 审稿与编辑，形式分析。Richard Ansah Herman：撰写 – 审稿与编辑，监督。Jie Qi：数据管理。Hong-Yu Guo：软件开发。Wei-Guo Zhao：资金获取。Jun Wang：监督，资金获取。Shuai You：撰写 – 审稿与编辑，软件开发，资源管理，方法学研究，资金获取，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

该项目得到了江苏省自然科学基金（BK20241862）、镇江市科技创新资助：社会发展项目（SH2023013）、国家自然科学基金（22278196）以及国家关键研发计划国际科技合作重点项目（2021YFE0111100）的支持。