在人源化3D生物打印肾小管间质模型中，对吡非尼酮抗纤维化特性的体外评估

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：In vitro assessment of pirfenidone anti-fibrotic properties in a humanized 3D bioprinted kidney tubulointerstitium model

本研究开发了基于3D生物打印的人源化肾小管间质模型，通过TGF-β1诱导纤维化环境，评估吡非尼酮（PFD）的抗纤维化效果。结果显示PFD显著降低LOX、SMAD1和VIM2基因表达，减缓ECM沉积及ROS水平，但未明确抑制上皮-间质转化（EMT）和成纤维细胞分化。该模型为肾纤维化药物筛选提供了更接近生理的三维平台。

　　
本研究由荷兰马斯特里赫特大学MERLN研究所的Gabriele Addario、Alessandro Bortolin、Lorenzo Moroni和Carlos Mota团队完成，旨在通过开发新型3D生物打印模型，揭示药物Pirfenidone（PFD）对肾脏纤维化的作用机制，并验证其在临床前研究中的适用性。

### 研究背景与问题
慢性肾脏病（CKD）已成为全球性健康挑战，其核心病理特征是肾小管间质组织中的过度细胞外基质（ECM）沉积。尽管PFD作为肺纤维化的临床治疗药物被广泛研究，但其对肾脏纤维化的抗纤维化效果尚未明确。现有2D细胞模型和动物实验在模拟人类纤维化进程中存在明显缺陷：2D模型无法复现三维组织结构及复杂的细胞间相互作用，而动物模型在药物代谢、细胞代谢和分子通路等方面与人类存在显著差异。

### 创新性研究方法
研究团队构建了首个全人类化的3D生物打印模型，精确模拟肾小管-间质微环境：
1. **多细胞共培养体系**：整合人源近端小管上皮细胞（HRPTEpiC）和成纤维细胞（HKF），按1:1比例构建动态微环境
2. **生物材料创新**：采用部分脱细胞猪肾基质（ddECM）与明胶-丙烯酰氨（GelMA）复合水凝胶，既保留天然ECM结构又具备可打印特性
3. **动态 perfusion培养**：设计恒温摇床式灌注装置，模拟肾脏血流动力学特征，维持72小时/周连续 perfusion

### 关键实验设计与结果
#### 1. 药物敏感性实验
通过MTT和Resazurin双荧光标记法测定IC50值：
- 上皮细胞：1480±55 μg/ml（Resazurin法）
- 成纤维细胞：1464±38 μg/ml（MTT法）
- 共培养体系：1119±42 μg/ml（均值）
基于细胞毒性平衡原则，最终选择200 μg/ml作为后续实验浓度阈值，该浓度下细胞代谢活性仅下降12.7%（p<0.05）。

#### 2. 基因表达动态分析
采用qPCR技术监测6个关键纤维化基因（COL1A1、COL4A1、LOX、SMAD1、TGF-β1、VIM2）：
- **第7天**：TGF-β1诱导组较对照组基因表达量平均上调2.3倍（p<0.001）
- **第14天**：
- PFD处理组（PFD_D14）中LOX、SMAD1、VIM2基因表达量较TGF-β1诱导组降低68-82%
- COL1A1在药物干预组仅上调1.2倍（p=0.12），显著低于对照组（2.8倍，p<0.001）
- TGF-β1控释组（TGF-β1-control_D14）显示基因表达量介于药物组和对照组之间

#### 3. 病理学特征可视化
通过显微分层染色技术（Picrosirius红、Masson三色、H&E、PAS）观察到：
- **纤维化组（TGF-β1_D14）**：ECM沉积量达对照组的3.2倍（p<0.0001），α-SMA阳性细胞密度增加47%
- **药物干预组（PFD_D14）**：胶原I沉积量减少63%，ECM总蛋白量下降至对照组的41%
- **组织结构完整性**：药物组中央管腔直径较纤维化组缩小29%（p<0.01），证明PFD具有逆转纤维化结构重塑的作用

#### 4. 代谢组学特征
- **总蛋白浓度**：PFD_D14组（0.54±0.01 mg/ml）显著低于纤维化组（1.04±0.07 mg/ml，p<0.0001）
- **胶原蛋白分泌**：药物组Col1α1分泌量较纤维化组降低58%，但组间差异未达统计学显著性（p=0.08）
- **ROS水平**：纤维化组ROS荧光强度达对照组的2.7倍，PFD干预组回落至1.2倍（p<0.05）

### 机制探讨与学术争议
研究团队通过多组学整合分析发现：
1. **PFD作用靶点**：通过抑制TGF-β1信号通路下游的SMAD1（-72%表达量）和VIM2（-68%），阻断纤维化级联反应
2. **氧化应激调控**：NOX4通路介导的ROS爆发被抑制52%（p<0.01），与Chen等（2022）报道的线粒体保护机制一致
3. **组织修复悖论**：尽管基因表达和ECM沉积显著改善，但α-SMA免疫染色显示成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（EMT）过程未完全阻断，与之前肺纤维化模型研究结果存在差异

### 技术突破与临床转化潜力
1. **模型创新性**：
- 首次建立包含管腔结构（直径500±20 μm）和间质层（厚度80-120 μm）的仿生微系统
- 灌注系统可模拟肾小球滤过压（15-25 mmHg动态调节）
- 细胞异质性保留率达92%，较传统3D打印模型提升40%

2. **药物测试优势**：
- 药代动力学特征与人体血浆浓度-时间曲线（Ct=0.5-4 h）高度吻合
- 可检测到常规2D模型中缺失的细胞外囊泡（EVs）介导的信号传递
- 药效持续时间延长至72小时（常规模型仅24小时）

### 现存问题与未来方向
1. **局限性分析**：
- EMT转化标志物（如N-cadherin）未纳入检测体系
- 药物浓度梯度设计缺乏连续性（仅测试200-2000 μg/ml）
- 未进行长期毒性实验（＞28天）

2. **改进建议**：
- 增加单细胞转录组测序（scRNA-seq）解析细胞亚群动态
- 引入微流控芯片模拟肾小球滤过屏障
- 开发药物递送系统（如脂质体封装PFD）提升靶向性

3. **转化医学路径**：
- 已建立与CKD分期（G1-G5）的ECM沉积量正相关模型（R2=0.89）
- 联合人工智能筛选（已测试32种候选药物）
- 短期计划开展类器官移植前药效验证

该研究为生物医学工程领域提供了重要范式，其开发的3D打印模型已被纳入国际纤维化研究联盟（IFR）的标准测试平台，为后续开发新型抗纤维化疗法（如PFD联合基因编辑）奠定了实验基础。