巨噬细胞中的USP14蛋白通过NLK蛋白的去泛素化作用抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路，从而增强免疫反应

《Cytokine》：Macrophage USP14 suppresses Wnt/β-catenin signaling via NLK deubiquitination to enhance immune response

巨噬细胞中USP14通过去泛素化NLK调控Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路介导炎症反应。

　　

赵明明|施俊杰|魏新奇|田文泽|陈月怡

南京医科大学淮安第一附属医院胸外科，中国淮安223300

摘要

巨噬细胞是关键的免疫细胞，它们在识别内源性和外源性病原体后通过促进炎症因子的释放来调节身体的免疫反应。USP14是一种重要的去泛素化酶，在多种细胞过程中发挥着重要作用，尤其是在调节免疫反应方面。本研究旨在探讨USP14在调节巨噬细胞免疫反应中的作用。通过质粒转染和慢病毒感染分别在RAW264.7细胞和小鼠骨髓巨噬细胞中过表达和敲低USP14。我们的研究表明，USP14的过表达增强了LPS诱导的炎症反应并促进了巨噬细胞的迁移，而USP14的敲低则产生了相反的效果。USP14与NLK相互作用，从而减弱Wnt/β-连环蛋白信号通路，并同时激活巨噬细胞中的NF-κB通路。USP14促进NLK的去泛素化，从而稳定其活性。此外，USP14抑制剂IU1可以降低巨噬细胞中的LPS诱导的炎症反应。从机制上看，巨噬细胞中的USP14通过促进NLK的去泛素化来维持其活性，抑制Wnt/β-连环蛋白通路，激活NF-κB通路，并增强细胞免疫反应。

引言

巨噬细胞是关键的免疫效应细胞，它们塑造宿主的免疫力并驱动多种疾病的发生和发展[1,2]，包括感染、自身免疫性疾病、肿瘤、过敏和代谢性疾病[[3], [4], [5]]。当检测到内源性或外源性危险信号时，模式识别受体（PRRs）会识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）[6]。这种识别会触发免疫反应，启动免疫细胞的招募，并刺激炎症因子的释放。组织和器官中的适度炎症有助于修复，而过度炎症则会加剧组织损伤[7]。

USP14是一种去泛素化酶，它与底物蛋白相互作用，促进其去泛素化，维持其活性，并调节细胞命运[8]。它在肿瘤、代谢性疾病和免疫相关疾病中起着关键作用[9]。在免疫背景下，USP14影响炎症通路和巨噬细胞的极化：它结合并去泛素化TRAF6，保持其活性并增强促炎反应；其抑制作用则促进自噬并减弱败血症模型中的NF-κB信号通路[10,11]。然而，USP14是否通过其他效应器来调控巨噬细胞反应尚不清楚。

Nemo样激酶（NLK）是一种丝氨酸/苏氨酸丝裂原活化蛋白（MAP）激酶，作为Wnt信号通路的负调节因子，通过指导细胞迁移、发育和分化来维持免疫稳态[12]。NLK通过直接磷酸化TCF4来抑制β-连环蛋白–LEF/TCF复合物的转录活性[13]。它还通过激活TAK1依赖的非经典Wnt级联反应以及TAK1结合蛋白2（TAB2）来对抗经典的Wnt/β-连环蛋白信号通路[14]。NLK通过调节IKK复合物并防止p65核转位来减弱NF-κB信号通路[15]。尽管有这些作用，但USP14与NLK在巨噬细胞中的潜在相互作用尚未明确。

我们假设USP14通过与NLK依赖的通路相互作用来影响Wnt–NF-κB的相互作用，从而调节巨噬细胞的炎症反应。为此，我们在RAW264.7细胞和小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中过表达和沉默了USP14。本研究阐明了USP14在炎症反应期间如何调节巨噬细胞活性，并揭示了相关机制，为开发治疗炎症相关疾病的新疗法提供了见解。

实验部分

小鼠和细胞培养

5-6周大的雄性C57BL/6 J小鼠在无特定病原体条件下饲养，使用异氟烷进行深度麻醉，并通过颈椎脱位人道处死。处死前未进行任何实验操作。确认死亡后，无菌地切除后肢，清除周围软组织，并采集股骨和胫骨以进行后续的骨髓分离。冲洗后的骨髓细胞用红细胞裂解缓冲液处理

USP14在LPS刺激下增强巨噬细胞的炎症反应

为了阐明USP14在巨噬细胞中的免疫调节功能，我们制备了过表达或敲低USP14的RAW264.7细胞，并用100 ng/mL的LPS刺激这些细胞24小时以模拟慢性炎症[16]。通过Western blot分析确认了转染效率（图1A-B）。在RAW264.7细胞中，RT-PCR分析显示，USP14的过表达增加了促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表达

讨论

虽然之前的研究已经强调了USP14在免疫调节中的作用，但我们的研究表明，巨噬细胞中的USP14与NLK相互作用，促进NLK的去泛素化，增强NLK的蛋白稳定性，抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路，激活NF-κB信号通路并增强细胞免疫反应。USP14抑制剂IU1显著降低了NLK的表达并减弱了这种反应。总之，我们的发现揭示了巨噬细胞中USP14的作用

患者出版同意书

不适用。

CRediT作者贡献声明

赵明明：验证、监督、资源管理、项目实施、研究。施俊杰：软件开发、项目管理、方法学、数据分析、数据管理。魏新奇：初稿撰写、验证、资源管理、方法学。田文泽：审稿与编辑、数据可视化、监督、资源管理、方法学、资金获取、数据分析。陈月怡：审稿与编辑、初稿撰写

伦理批准和参与同意

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南，并得到了南京医科大学动物伦理委员会的批准。

资助

该项目得到了江苏省卫生健康委员会（资助编号：H2023083）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

无