B. sub lipase A突变体I157V的催化活性增强机制研究及其在生物柴油生产中的应用

《Environmental Toxicology and Pharmacology》：Mechanistic investigation of the enhanced catalytic activity of B. sub lipase A mutant I157V and its application in biodiesel production

分子模拟揭示Bacillus subtilis酯酶I157V突变体通过优化底物结合提升催化效率，废油转化率87%实现45%增产。

　　

钟妮|贾昭|周慧敏|贾华云|高二斌|郭中健|胡朝阳|马尚尚|陈勇

江苏大学生命科学学院，镇江212013，中国

摘要

优化用于长链脂肪酸酯酯交换的脂肪酶对于提高生物柴油产量至关重要，尤其是利用回收的食用油生产生物柴油时。在这项研究中，我们应用易出错的PCR技术基于Bacillus subtilis脂肪酶A（BSLA）创建了一个多样化的突变库。通过96孔高通量筛选选出的I157V突变体，其催化效率（k_cat/K_m）比野生型酶高出六倍以上。分子对接和动态模拟的结果表明，该突变改变了底物在酶催化中心的对齐方式，使得非生产性的结合模式减少，增强了酶与底物之间的相互作用，从而提高了催化效果。在使用废弃食用油作为原料生产生物柴油的过程中，I157V突变体在10小时内的甲基酯产量达到了87%（w/w），相比野生型的60%（w/w）有了约45%的提升。这些发现不仅推动了工业生物催化领域的酶工程发展，也展示了定向突变在支持可持续能源解决方案方面的潜力。

引言

生物柴油作为一种可再生且环保的生物燃料，已成为化石燃料的可行替代品。其生产具有显著的环境优势，例如减少温室气体排放以及降低空气、水和土壤污染[1]、[2]。通过利用麻疯树油[3]、酸化棕榈油[4]和废弃食用油[5]等非食用原料，生物柴油有助于提高废物资源利用率，支持全球可持续发展。

目前，生物柴油的生产主要采用三种方法：i) 化学酯交换：这种方法使用强酸或强碱将甘油三酯有效转化为生物柴油，但会产生复杂的副产物，需要复杂的后处理，并带来相当大的环境挑战[6]、[7]；ii) 加氢：通过加氢作用，植物油或动物脂肪被转化为生物柴油，在化学性质上类似于石化柴油。尽管这种方法有效，但由于设备成本和工艺要求较高，因此费用较高[8]；iii) 酶催化酯交换：这种方法因环保性能好且在温和条件下操作而不产生有害副产物而越来越受欢迎。然而，其在工业中的广泛应用受到高酶成本和反应时间较长的限制。

脂肪酶在酶驱动的生物柴油生产中起着关键作用，通过促进甘油三酯的酯交换来生产生物柴油[9]。开发具有更高催化能力的低成本脂肪酶是应对生物柴油生产挑战的关键，从而推动该行业的发展，并支持其作为环保选项的采用[10]。

被称为Bacillus subtilis脂肪酶A（BSLA）的181个氨基酸α/β水解酶[11]、[12]因其广泛的表达宿主、高产量和较低的成本而受到关注。先前的研究通过突变和理性设计成功提高了其热稳定性[13]、pH耐受性[14]和有机溶剂耐受性[15]。近年来，有一些关于使用Bacillus subtilis脂肪酶将食用油转化为生物柴油的报道[16]、[17]、[18]。然而，这些研究主要集中在探索不同工程条件（包括金属离子、温度、pH值和固定化参数）对反应的影响，因为这些因素对反应转化至关重要。然而，专门针对显著提高其催化活性的研究相对较少。这样的进展至关重要，因为高催化效率有助于有效水解甘油三酯——这是废弃食用油的主要成分，有可能提高生物柴油的生产效率[19]、[20]。

然而，如何增强B.sub脂肪酶A的固有催化活性仍是一个尚未充分探索的领域。因此，本研究旨在系统地研究提高催化活性的机制，并探索工程化脂肪酶A在生物柴油生产中的工业应用。

利用先进的生物技术方法充分利用B. subtilis脂肪酶A，可以在甘油三酯水解方面取得重大进展，进一步促进可再生能源生产和环境可持续性，同时解决废弃油处理问题。

在这项研究中，我们采用了传统的96孔板高通量筛选方法来鉴定增强型的Bacillus subtilis脂肪酶A突变体。经过多轮筛选，我们成功发现了一个名为I157V的突变体，其催化活性比野生型酶高出六倍以上。随后，我们进行了分子模拟和实验验证，以系统研究残基157的作用机制，从而阐明其性能提升的原因。最终，我们通过酯交换反应评估了固定化I157V突变体的生物柴油生产性能。

部分内容摘录

化学品

p-硝基苯基棕榈酸酯（pNPP）从美国Sigma-Aldrich公司购买。GeneMorph II随机突变试剂盒从美国德克萨斯州Agilent Technologies公司购买，非干扰蛋白测定试剂盒从上海Sangon Biotech公司购买。植物油从商业公司购买。所有化学品均为分析级或试剂级。

B. sublipase脂肪酶A的基因克隆、表达和纯化

编码脂肪酶A的基因（命名为BSLA）及其包含信号肽的5′端序列

获得高活性I157V突变体

定向进化是一种经过验证且高效的技术，通过结合随机突变和高通量筛选来增强酶变体的性能。先前的研究已广泛采用定向进化来提高脂肪酶对特定底物的活性[35]或提高其对甲醇的耐受性[36]、[37]、[38]，以及提高Bacillus subtilis脂肪酶A的热稳定性[39]、[40]和过氧化氢耐受性[42]。

结论

总之，我们改造了Bacillus subtilis脂肪酶A的I157V突变体，这种生物催化剂具有更高的催化效率、更强的pH稳定性和更高的生物柴油产量。该突变通过重构酶-底物复合物的构象，使其更倾向于产生有效的单一状态，而非野生型所呈现的次优平衡状态，从而实现了长链甘油三酯水解效率六倍的提升，以及酯交换产量的增加。

CRediT作者贡献声明

陈勇：监督。 胡朝阳：验证、监督。 马尚尚：监督。 高二斌：验证、监督。 郭中健：验证、监督。 周慧敏：可视化、研究、数据分析。 贾华云：研究。 钟妮：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、资源获取、方法论、资金申请、数据分析、概念构思。 贾昭：研究、数据分析。

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在完成手稿初稿后，我们使用了ChatGPT来提高可读性和语言表达。随后对输出文本进行了审查和编辑，以确保其准确性和与原始意图的一致性。作者对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2021YFC2103004）、江苏省碳达峰碳中和科技创新项目（现代农业）以及中国江苏省镇江市重点研发计划（现代农业）（NY2023013）的财政支持。