靶向PLK1或WEE1激酶抑制同源重组修复通路治疗BRCA1/2野生型高级别浆液性卵巢癌

《Cell Death & Disease》：PLK1 or WEE1 inhibition targets homologous recombination repair proficiency in BRCA1/2 wild-type high-grade serous ovarian cancer

本研究针对BRCA1/2野生型(WT)且同源重组修复(HR)功能正常的高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)患者对铂类化疗和PARP抑制剂反应有限的临床难题，探讨了PLK1抑制剂(volasertib)和WEE1抑制剂(adavosertib)的治疗潜力。研究结果表明，两种抑制剂可通过诱导DNA损伤、抑制HR修复(减少RAD51灶)并引发有丝分裂灾难，选择性杀伤BRCA-WT/HRP肿瘤细胞。该研究为HRP型卵巢癌的精准治疗提供了新的靶向策略。

　　

卵巢癌是全球第三大常见的妇科恶性肿瘤，其中高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是最常见且致死率最高的亚型。部分HGSOC患者携带BRCA1或BRCA2基因突变，导致同源重组修复(Homologous Recombination, HR)功能缺陷(HRD)，这类肿瘤对铂类化疗药物和PARP（多聚ADP-核糖聚合酶）抑制剂尤为敏感。然而，约半数HGSOC患者为BRCA1/2野生型(BRCA-WT)，其HR功能正常(HRP)，对上述标准治疗方案反应不佳，预后较差，构成了临床治疗的重大挑战。因此，探索针对BRCA-WT/HRP型HGSOC的有效治疗策略迫在眉睫。

为了应对这一挑战，由Qian Xi、Akiko Kunita、Katsutoshi Oda等领导的研究团队在《Cell Death & Disease》上发表了他们的最新研究成果。他们提出了一种新的思路：通过靶向调控细胞周期和DNA修复的关键激酶PLK1（Polo样激酶1）和WEE1，来破坏BRCA-WT/HRP肿瘤细胞的稳态，诱导其死亡。他们的研究表明，抑制PLK1或WEE1能够选择性地在BRCA-WT/HRP的HGSOC细胞中引发DNA损伤、破坏HR修复并导致有丝分裂灾难，从而有效抑制肿瘤生长，这为攻克这类难治性卵巢癌提供了新的希望。

研究人员在开展这项研究时，综合运用了多种关键技术方法。他们利用公共数据库（TCGA和GTEx）进行了生物信息学分析，比较了PLK1和WEE1在卵巢癌与正常组织中的表达差异及相关性。研究使用了涵盖BRCA-WT和BRCA突变(BRCA-Mut)状态的多种HGSOC细胞系模型，通过细胞活力检测(CCK-8法)、流式细胞术进行细胞周期和凋亡分析，并利用免疫荧光技术观察DNA损伤修复标志物（如γH2AX、53BP1、RAD51 foci）的变化以及细胞骨架和中心体形态。蛋白质印迹(Western Blot)被用于检测关键蛋白的表达和修饰水平。此外，研究还通过小干扰RNA(siRNA)敲低技术验证了特定基因（如PLK1、WEE1、DNA-PKcs）的功能。最后，研究团队在BRCA-WT和BRCA-Mut的细胞系衍生异种移植(CDX)和患者来源异种移植(PDX)小鼠模型中，评估了PLK1抑制剂volasertib和WEE1抑制剂adavosertib的体内抗肿瘤效果，并通过免疫组织化学(IHC)对肿瘤组织进行了分子标志物分析。

BRCA-WT HGSOC细胞对PLK1和WEE1抑制表现出高敏感性

研究人员首先发现PLK1和WEE1在卵巢癌组织中显著高表达，且两者表达正相关。随后，他们在8个HGSOC细胞系（包括4个BRCA突变系）中测试了volasertib和adavosertib的敏感性。结果显示，BRCA-WT细胞对两种抑制剂的敏感性远高于BRCA-Mut细胞，其IC₅₀值显著更低。通过siRNA敲低PLK1或WEE1基因，也特异性抑制了BRCA-WT细胞的增殖。此外，通过检测DNA损伤剂 cisplatin 诱导的RAD51焦点形成，确认了所使用的BRCA-WT细胞（SK-OV-3和TYK-nu）具有HR功能，而BRCA-Mut细胞（JHOS-2和OVSAHO）则表现为HR缺陷。

PLK1/WEE1抑制诱导BRCA-WT细胞周期失调和凋亡

流式细胞术分析显示，volasertib和adavosertib处理能显著增加BRCA-WT细胞中亚G1期（代表凋亡细胞）的比例，并减少G1期细胞，同时引起M期细胞积累。Volasertib还诱导了BRCA-WT细胞产生多倍体(>4N DNA含量)。免疫荧光观察发现，volasertib处理导致BRCA-WT细胞出现异常的纺锤体结构、α-微管组织紊乱和不完全的中心体分离，表明其有丝分裂过程存在缺陷。细胞形态学分析进一步证实，volasertib引起BRCA-WT细胞体积增大和核质比例变化，这与PLK1抑制导致的胞质分裂失败相一致。

PLK1/WEE1破坏导致BRCA-WT细胞HR修复抑制及BRCA突变细胞NHEJ驱动的耐药

为了探究DNA修复通路的变化，研究人员检测了DNA双链断裂标志物γH2AX以及HR通路标志物RAD51和NHEJ通路标志物53BP1。在BRCA-WT细胞中，PLK1或WEE1抑制显著增加了γH2AX焦点，表明DNA损伤积累；同时，53BP1焦点也增加，提示NHEJ通路被补偿性激活。然而，关键的是，两种抑制剂处理显著减少了由cisplatin诱导的RAD51焦点形成，表明HR修复功能受到抑制。在BRCA-Mut细胞中，基线水平即缺乏RAD51焦点，53BP1焦点呈组成性高表达，且对抑制剂处理无显著反应。蛋白质印迹分析显示，在BRCA-WT细胞中，抑制剂处理导致凋亡标志物（cleaved PARP, cleaved caspase-3）上调，同时HR相关蛋白（CHK1, CHK2, RAD51）表达下降；而在BRCA-Mut细胞中，DNA-PKcs（NHEJ关键蛋白）基础表达水平较高且稳定。这些结果表明，BRCA-WT细胞在抑制剂作用下HR功能被抑制且无法有效激活NHEJ进行补偿，而BRCA-Mut细胞则依赖于组成性活跃的NHEJ通路维持生存。

BRCA突变细胞依赖于NHEJ修复通路

基于上述发现，研究人员推测BRCA-Mut细胞的耐药性与NHEJ通路，特别是DNA-PKcs的活性有关。实验证实，BRCA-Mut细胞在mRNA和蛋白水平上确实表达更高水平的DNA-PKcs。使用DNA-PKcs抑制剂NU7441处理，BRCA-Mut细胞表现出比BRCA-WT细胞更高的敏感性。更重要的是，预先用NU7441处理或用siRNA敲低DNA-PKcs，能显著增强BRCA-Mut细胞对volasertib或adavosertib的敏感性，逆转其耐药表型。这直接证明了BRCA-Mut细胞对NHEJ通路的高度依赖性。

PLK1和WEE1抑制在BRCA-WT而非BRCA突变异种移植模型中抑制肿瘤生长

体内实验进一步验证了体外研究的结论。在BRCA-WT的SK-OV-3细胞系衍生模型和患者来源异种移植(PDX)模型中，volasertib或adavosertib治疗三周能显著抑制肿瘤生长，并伴随肿瘤组织中cleaved PARP表达上调（表明凋亡增加）以及γH2AX水平升高（表明DNA损伤积累）。在SK-OV-3模型中，volasertib处理还观察到了异常的有丝分裂图像。相反，在BRCA-Mut的PDX模型中，两种抑制剂均未引起显著的肿瘤缩小、有丝分裂异常或凋亡标志物增加。免疫组化分析显示，BRCA-Mut PDX模型存在BRCA1蛋白丢失，基线即有53BP1表达，且缺乏RAD51表达，与其HRD状态一致；而药物治疗后，BRCA-WT模型中增殖标志物Ki67阳性细胞减少。

综上所述，本研究深入揭示了PLK1和WEE1抑制在BRCA-WT/HRP和BRCA-Mut/HRD HGSOC细胞中引发截然不同命运的分子机制。在BRCA-WT/HRP细胞中，PLK1抑制扰乱了正常的有丝分裂进程（纺锤体组装、染色体分离），同时削弱了其对HR修复的支持功能；WEE1抑制则通过废除G2/M检查点，迫使带有未修复DNA损伤的细胞提前进入有丝分裂，并直接损害BRCA2介导的RAD51加载。这两种干预均导致HR功能崩溃，而BRCA-WT细胞由于其NHEJ功能相对较弱，无法有效补偿，最终因无法解决的DNA损伤和异常有丝分裂而走向死亡（有丝分裂灾难）。相反，BRCA-Mut/HRD细胞本就缺乏功能性HR通路，转而高度依赖组成性活跃的NHEJ通路来维持基因组稳定。因此，尽管PLK1或WEE1抑制同样可能引起DNA损伤，但活跃的NHEJ通路能够予以修复，从而使细胞存活下来，表现为耐药。

这项研究的意义在于，它明确指出了BRCA1/2野生型且同源重组功能正常的高级浆液性卵巢癌的一个独特弱点，即其对PLK1或WEE1抑制的敏感性。这为约占HGSOC半数的、目前缺乏有效靶向治疗的HRP患者群体提供了一个极具潜力的精准治疗方向。研究不仅阐明了其作用机制依赖于破坏DNA修复通路平衡（抑制HR且无法有效激活NHEJ），还通过体内外实验证实了疗效。此外，研究还提示，对于BRCA突变型患者，联合使用NHEJ通路抑制剂（如DNA-PKcs抑制剂）可能克服其对PLK1/WEE1抑制剂的固有耐药性。这些发现为开发基于DNA修复通路状态的个体化卵巢癌治疗策略奠定了坚实的理论基础，具有重要的临床转化价值。未来的临床研究需要进一步验证HR proficiency作为预测PLK1/WEE1抑制剂疗效的生物标志物，并探索这些抑制剂与现有化疗药物（如紫杉醇、吉西他滨）联合应用的潜力，以期改善这类难治性卵巢癌患者的预后。