GADD45β通过干扰NEMO-RIPK1-RIPK3相互作用抑制RIPK3介导的NF-κB活化

《Cell Death Discovery》：GADD45β inhibits RIPK3-mediated NF-κB activation by interfering with NEMO-RIPK1-RIPK3 interactions

本研究揭示了GADD45β作为RIPK3驱动炎症信号的新型负调控因子。为解决RIPK3介导NF-κB活化机制不清的问题，研究人员发现GADD45β直接结合RIPK3，干扰NEMO-RIPK1-RIPK3复合物形成，从而选择性抑制NF-κB通路及CXCL8等炎性因子产生，为调控免疫原性细胞死亡提供了新靶点。

　　

在细胞死亡的复杂世界里，坏死性凋亡（necroptosis）以其独特的“轰轰烈烈”方式引人注目。当细胞遭遇病毒入侵、炎症因子风暴或其他致命压力时，若常规的凋亡程序被抑制，它们可能会启动这种细胞“爆炸”式的死亡方式。细胞膜破裂，内容物释放，就像拉响警报一样，激活强烈的免疫炎症反应。指挥这场“细胞风暴”的核心人物是受体相互作用蛋白激酶3（Receptor-Interacting Protein Kinase 3, RIPK3）。它不仅通过磷酸化MLKL蛋白执行细胞死亡程序，还能激活核因子κB（NF-κB）信号通路，促进炎症因子产生，在感染、自身免疫病和肿瘤微环境调控中扮演双重角色。然而，科学家们对RIPK3如何精确调控NF-κB活化这一关键过程仍知之甚少，特别是是否存在“刹车”分子能够在不引起细胞死亡的情况下，精细调节其炎症输出，这成为了领域内亟待解决的重要问题。

正是在这样的背景下，Carmela Casale等研究人员在《Cell Death Discovery》上发表了他们的最新发现。他们关注到一个名为GADD45β（Growth Arrest and DNA Damage-inducible β）的蛋白质。GADD45β是细胞应对压力时产生的分子，已知能抑制JNK信号通路，影响炎症和肿瘤进程。更有趣的是，近期研究发现GADD45β本身也能形成类似淀粉样的聚集体，这让人联想到RIPK3激活所依赖的RHIM（RIP Homotypic Interaction Motif）结构域介导的淀粉样纤维形成过程。这提示我们，GADD45β是否可能通过物理相互作用，直接调控RIPK3的功能呢？

为了回答这个问题，研究团队运用了多种关键技术方法。他们通过生物层干涉技术（BLI）直接证明了GADD45β与RIPK3的高亲和力结合；利用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）技术在细胞模型中验证了蛋白质间的相互作用及其对复合物组装的影响；通过NF-κB荧光素酶报告基因实验评估信号通路活性；构建了多西环素（Doxycycline）诱导的基因表达系统来精确控制GADD45β的表达水平；采用细胞活力检测（CellTiter-Glo）和 caspase-3/7活性测定分析细胞命运；并通过免疫荧光、核质分离技术以及蛋白质印迹（Western Blot）观察NF-κB关键亚基p65的核转位动态；同时利用定量PCR（qPCR）和Lumit免疫分析法检测炎症因子基因表达和分泌水平。实验主要使用了人胚胎肾细胞HEK293T（包括NEMO基因敲除株）和结直肠癌细胞HT-29等细胞系。

GADD45β干扰RIPK1-RIPK3复合物形成及RIPK3自身关联的直接结合

研究人员首先通过精确的生物物理实验——生物层干涉技术（BLI）发现，重组人GADD45β（rhGADD45β）能够以纳摩尔级别的高亲和力（K_D= 1.73 ± 0.03 × 10^-9M）直接结合重组人RIPK3（rhRIPK3），且结合呈剂量依赖性。随后，在细胞模型中，他们证实GADD45β与RIPK3的结合不依赖于RIPK3的RHIM结构域。更重要的是，GADD45β的存在显著抑制了RIPK1与RIPK3之间的相互作用，而RIPK1与RIPK3正是通过各自的RHIM结构域结合形成功能性淀粉样复合物，这是坏死性凋亡信号传导的基石。有趣的是，GADD45β并不影响RIPK3与另一个关键支架蛋白NEMO（NF-κB Essential Modulator）的结合。对于缺失了RHIM结构域的RIPK3突变体（ΔRHIM），GADD45β与其结合反而更强，这提示GADD45β和RIPK1可能在RIPK3上存在竞争性结合。的确，当过量表达RIPK1时，可以部分恢复被GADD45β抑制的RIPK1-RIPK3相互作用。此外，GADD45β还能抑制RIPK3自身的同源寡聚化（RIPK3-RIPK3 interaction）。这些结果共同表明，GADD45β通过直接结合RIPK3，特异性地干扰了其RHIM结构域介导的蛋白复合物形成，从而可能负向调控下游信号。

GADD45β以剂量依赖方式抑制RIPK3介导的经典NF-κB活化

既然RIPK1-RIPK3相互作用对其激活NF-κB至关重要，研究团队接下来探究了GADD45β对NF-κB通路的影响。通过NF-κB荧光素酶报告基因实验，他们发现GADD45β的表达能使RIPK3诱导的NF-κB活性降低约80%。即使对于失去激酶活性、无法引发坏死但依然能通过RHIM域激活NF-κB的RIPK3突变体（D160N），GADD45β同样能抑制其功能。研究表明，RIPK3激活NF-κB依赖于经典的IKK（IκB kinase）复合物及其支架蛋白NEMO，因为在NEMO基因敲除（NEMO-KO）细胞中，RIPK3无法激活NF-κB。研究人员发现RIPK3能与NEMO、RIPK1和IKK形成一个大分子复合物，而GADD45β则削弱了RIPK3与该复合物的关联，但并不直接结合NEMO。重要的是，GADD45β的选择性很强，它抑制RIPK3驱动的NF-κB活化，却不影响由肿瘤坏死因子（TNF）刺激引起的、主要依赖RIPK1的NF-κB激活。利用可诱导表达系统，研究人员证实，GADD45β对NF-κB的抑制作用是剂量依赖性的，即使低水平表达也能生效。

GADD45β干扰结肠癌细胞坏死性凋亡过程中的p65核转位和细胞命运

为了在更接近生理状态的模型中进行验证，研究团队在HT-29结肠癌细胞中构建了可诱导表达GADD45β的系统。在诱导坏死性凋亡的经典模型（使用TNFα、SMAC类似物BV6和caspase抑制剂zVAD，合称TBz处理）中，NF-κB的活化呈现双相特征：早期短暂激活和晚期（4-8小时）持续激活，后者与炎症因子基因表达和细胞死亡执行相关。研究发现，GADD45β的表达并不影响RIPK3的蛋白水平和亚细胞定位，也不干扰早期的p65核转位。然而，在TBz处理5-6小时后，GADD45β显著降低了p65的核定位，这表明它特异性地抑制了坏死性凋亡晚期持续的NF-κB信号。在细胞命运方面，短期（6-8小时）内GADD45β并不改变细胞存活率，但延长刺激时间至18小时，表达GADD45β的细胞表现出更好的生存优势，并且这种保护作用可被RIPK3特异性抑制剂GSK-872所逆转，说明其依赖于抑制RIPK3。另一方面，当使用IKK抑制剂（IKK-16）完全阻断NF-κB通路时，会引发强烈的caspase依赖性凋亡，而GADD45β的表达并未加剧这种凋亡，表明其作用是选择性地调节RIPK3信号，而非普遍促进细胞存活或死亡。

诱导型GADD45β表达抑制坏死性凋亡过程中IKK依赖的CXCL8产生

炎症因子的产生是坏死性凋亡引发免疫反应的核心。研究人员进一步检测了多个NF-κB靶基因的表达。结果发现，在TBz诱导的坏死性凋亡过程中，GADD45β能显著抑制趋化因子CXCL8（IL-8）和CXCL2的mRNA表达和蛋白质分泌，而对IL-1β和ICAM1等分子的表达影响不大。这种抑制效应同样依赖于IKK复合物的活性，因为IKK抑制剂也能完全阻断CXCL8的产生。时间进程分析显示，GADD45β能在整个坏死性凋亡过程中持续抑制CXCL8的分泌。这表明GADD45β能够精细地塑造由RIPK3激活所引发的炎症因子谱，而非简单地关闭所有NF-κB靶基因。

综上所述，这项研究首次揭示了GADD45β是RIPK3信号通路的一个关键新型负调控因子。其核心结论在于：GADD45β通过高亲和力直接结合RIPK3，以一种不依赖于RHIM结构域的方式，竞争性地干扰RIPK1-RIPK3及RIPK3自身寡聚体的形成，进而破坏包含NEMO和IKK的信号复合物稳定性，最终选择性地抑制RIPK3驱动的经典NF-κB信号通路活化。这一相互作用的功能性后果是，GADD45β能够在不显著影响短期细胞存活或促进凋亡的前提下，特异性地削弱如CXCL8/CXCL2等关键趋化因子的产生，并在长期炎症压力下赋予细胞生存优势。

这项研究的深刻意义在于它将两个重要的生物学领域——应激蛋白GADD45β家族和坏死性凋亡炎症信号——紧密联系起来。研究结果提出了一个名为“GADD45β-RIPK3轴”的炎症调控新概念，为理解细胞如何在死亡与炎症之间进行“权衡”提供了新的理论框架。特别是在“亚致死性坏死性凋亡”（sublethal necroptosis）模型中，即RIPK3部分激活足以驱动慢性炎症和肿瘤进展但不足以立即杀死细胞的情况下，GADD45β可能扮演了重要的“刹车”角色，将RIPK3的活性维持在促炎而非致死的水平。这为治疗一系列与失调的细胞死亡和炎症相关的疾病，如自身免疫病、神经退行性疾病和癌症，提供了新的潜在靶点和思路（例如，通过调控GADD45β来增强肿瘤免疫原性或抑制慢性炎症）。未来的研究方向包括在动物模型和原代免疫细胞中验证这一机制，解析GADD45β与RIPK3的复合物结构，以及探索该通路在其他病理条件下的作用。