缺氧通过EIF2AK3依赖的PI3K/AKT信号通路及mTOR非依赖机制调控非小细胞肺癌顺铂耐药性研究

《Cell Death Discovery》：Hypoxia-triggered autophagy modulates cisplatin resistance in non-small cell lung Cancer via EIF2AK3-dependent PI3K/AKT signaling and mTOR-independent mechanisms

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)顺铂(DDP)耐药性这一临床难题，深入探讨了缺氧微环境通过EIF2AK3调控自噬影响化疗耐药的分子机制。研究人员发现缺氧条件下EIF2AK3表达上调，通过PI3K/AKT信号通路（不依赖mTOR）激活保护性自噬，从而增强肿瘤细胞对DDP的抵抗能力。该研究为克服NSCLC化疗耐药提供了新的靶向治疗策略。

　　

在肺癌治疗领域，非小细胞肺癌(NSCLC)作为最常见的肺癌亚型，占所有肺癌病例的80-85%，其治疗困境尤为突出。由于早期诊断困难，大多数患者确诊时已处于晚期或转移阶段，五年生存率不足15%，这一严峻现实迫使医学界不断寻求更有效的治疗策略。顺铂(DDP)作为晚期不可切除肿瘤患者的常用化疗药物，虽然在一定程度上能够控制病情，但耐药性的频繁发生导致不良反应增加和复发率升高，严重制约了其临床疗效。这一棘手问题背后的分子机制，特别是肿瘤微环境如何影响化疗敏感性，成为当前研究的热点。

肿瘤微环境中的缺氧条件被认为是推动化疗耐药的关键因素之一。高达90%的实体瘤存在缺氧区域，这是由于快速生长的肿瘤团块血供不足导致的氧气供应不足。在缺氧状态下，肿瘤细胞会启动一系列适应机制来维持生存，其中自噬作为细胞内重要的降解系统，扮演着双刃剑的角色。自噬最初被认为是一种肿瘤抑制机制，但随着肿瘤进展和面临恶劣环境，它转变为支持肿瘤在恶劣微环境中存活的保护机制。尤其值得注意的是，自噬激活已被证明能够促进肿瘤增殖并赋予基于DDP的化疗耐药性。

在这项发表于《Cell Death Discovery》的研究中，傅继定、徐伟、王格等研究人员将目光投向了一个关键分子——EIF2AK3（真核翻译起始因子2α激酶3，也称为PERK）。EIF2AK3是一种内质网应激感受器，作为未折叠蛋白反应(UPR)的重要调节因子，它能够加强自噬信号通路并促进化疗耐药性的增强。缺氧会干扰内质网内的蛋白质折叠，随之而来的内质网应激通过诱导EIF2AK3/PERK激活UPR通路。前期研究表明，UPR的诱导促进肿瘤细胞存活，使实体瘤能够应对缺氧和生长因子剥夺。更重要的是，EIF2AK3/PERK已被认为是与肺癌风险相关的内质网驻留传感器之一。

基于这些观察，研究团队提出假设：EIF2AK3/PERK在调节缺氧诱导的自噬和NSCLC化疗耐药中起着关键作用。为了验证这一假设，他们开展了一系列精细的实验，探讨缺氧对NSCLC细胞处理化疗药物DDP的影响，分析自噬对缺氧诱导的DDP耐药性的影响，并在体外和体内验证EIF2AK3在调节缺氧诱导的自噬和PI3K/AKT/mTOR信号通路中的作用。

研究团队主要运用了细胞培养与处理、基因操作（包括短发夹RNA敲减和过表达）、药物敏感性检测（CCK-8法）、细胞凋亡分析（流式细胞术）、免疫荧光染色、动物异种移植模型、免疫组织化学和蛋白质印迹法(Western blot)等关键技术方法。实验使用了来自中国科学院细胞库的A549和95D两种NSCLC细胞系，并通过STR分析和支原体检测确保细胞质量。动物实验使用了BALB/c裸鼠，所有程序均遵循国际动物研究指导原则并获得伦理批准。

缺氧上调NSCLC细胞中EIF2AK3、HIF-1α和自噬水平

研究人员首先探讨了缺氧对NSCLC细胞EIF2AK3表达和自噬的影响。将A549和95D细胞置于缺氧条件下培养0、6、12和24小时后，蛋白质印迹分析显示，EIF2AK3、HIF-1α的蛋白水平和LC3-II/I比值在这两种细胞系中均随时间推移逐渐增加。定量分析证实了缺氧条件下这些蛋白的显著上调。基于这些发现，研究人员选择24小时缺氧条件进行后续实验。

缺氧诱导的自噬促进NSCLC细胞的DDP耐药性

为确定缺氧诱导的自噬是否介导DDP耐药性，研究团队用自噬抑制剂3-MA处理A549和95D细胞，并暴露于缺氧环境24小时。免疫荧光染色显示，缺氧条件下观察到的LC3斑点增加被3-MA处理逆转。蛋白质印迹分析同样表明，缺氧条件下升高的LC3-II/I比值被3-MA减弱。CCK-8实验显示，3-MA以剂量依赖方式逆转了缺氧诱导的DDP处理后细胞存活率增加。流式细胞术证实缺氧减少了DDP诱导的细胞凋亡，而这一效应被3-MA恢复。这些结果表明自噬在缺氧介导的NSCLC细胞DDP耐药性中起关键作用。

EIF2AK3敲减抑制自噬并增强DDP细胞毒性

研究人员通过功能缺失实验探讨EIF2AK3在自噬和DDP耐药性中的作用。免疫荧光和蛋白质印迹分析表明，转导sh-EIF2AK3的A549和95D细胞中LC3表达显著降低。在常氧条件下，EIF2AK3敲减以剂量依赖方式降低了细胞对DDP的存活率，并显著增加细胞凋亡，表明EIF2AK3有助于基础自噬和化疗耐药性。

EIF2AK3增强缺氧诱导的自噬和DDP耐药性

为评估EIF2AK3在缺氧诱导的DDP耐药性中的作用，研究人员将A549和95D细胞转导sh-EIF2AK3或Ov-EIF2AK3后暴露于缺氧环境。蛋白质印迹分析证实了sh-EIF2AK3转导细胞中EIF2AK3的有效敲减，以及Ov-EIF2AK3转导细胞中EIF2AK3的成功过表达。相应地，自噬标志物LC3-II/I的水平在EIF2AK3敲减后降低，而在EIF2AK3过表达后增加。LC3的免疫荧光染色进一步验证了这些变化。功能实验显示，EIF2AK3敲增强缺氧条件下的DDP细胞毒性和凋亡，而过表达则赋予耐药性。这些结果表明EIF2AK3是缺氧诱导的自噬和DDP耐药性的关键介质。

EIF2AK3以mTOR非依赖方式调节PI3K/AKT信号通路

PI3K/AKT信号通路是癌症细胞存活和耐药性的关键调节因子。为研究EIF2AK3是否在缺氧条件下影响这一通路，研究人员检测了A549和95D细胞中PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达。EIF2AK3敲减显著降低p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值，而EIF2AK3过表达则显著增加这些磷酸化水平。值得注意的是，p-mTOR/mTOR的变化极小且不一致，表明EIF2AK3主要通过PI3K/AKT激活调节缺氧诱导的DDP耐药性，而不依赖典型的mTOR信号。这些发现表明EIF2AK3通过激活PI3K/AKT通路促进NSCLC细胞的化疗耐药性，而mTOR可能不是这一背景下的主要下游效应器。

自噬激活逆转EIF2AK3敲减的效果

为确认自噬的贡献，研究人员用自噬激活剂雷帕霉素(Rapa，10μM)处理转导sh-EIF2AK3的A549和95D细胞，然后暴露于缺氧环境。免疫荧光染色显示，Rapa处理逆转了EIF2AK3敲减导致的LC3阳性斑点减少。蛋白质印迹分析进一步证明，EIF2AK3敲减后观察到的降低的LC3-II/LC3-I比值被Rapa处理显著恢复。与这些结果一致，雷帕霉素处理逆转了sh-EIF2AK3对p-PI3K和p-AKT水平的抑制效果。值得注意的是，p-mTOR水平在这些条件下也被Rapa部分恢复。鉴于Rapa经典地抑制mTOR活性，p-mTOR的这种部分恢复可能反映了mTOR磷酸化的复杂调节，包括缺氧暴露的NSCLC细胞中可能的反馈或补偿机制。

EIF2AK3敲减通过抑制自噬增强体内DDP疗效

为研究EIF2AK3在体内DDP耐药性中的作用，研究人员建立了使用转导sh-EIF2AK3或sh-NC的A549细胞的异种移植模型。当平均肿瘤体积达到约50 mm³时，小鼠接受DDP和/或Rapa的腹腔注射。EIF2AK3敲减显著降低肿瘤生长，这一效应被Rapa处理部分逆转。至第42天，与对照肿瘤相比，来自sh-EIF2AK3转导的A549细胞的肿瘤在DDP处理后的大小和重量显著降低，而Rapa共同处理减弱了这种减少。免疫组织化学证实了肿瘤组织中EIF2AK3的有效敲减，这一效果被Rapa缓解。蛋白质印迹分析显示，sh-EIF2AK3肿瘤中cleaved caspase-3增加，LC3-II/I、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平降低，所有这些都被Rapa逆转。值得注意的是，虽然EIF2AK3敲减在体外和体内条件下一致降低p-mTOR，但用Rapa激活自噬导致p-mTOR水平部分恢复，表明自噬诱导过程中存在复杂的反馈调节。

研究结论和讨论部分强调了这一发现的重要意义。尽管近年来在提高DDP对NSCLC疗效方面取得了进展，但耐药性的发展仍然是一个主要挑战，常常导致治疗失败、肿瘤进展或复发。自噬作为一种细胞保护机制，越来越被认识到能够保护癌细胞免受化疗诱导的凋亡。在诱导自噬的刺激中，缺氧是一个关键因素，使癌细胞能够在化疗应激下存活。本研究观察到缺氧暴露导致A549和95D细胞中HIF-1α表达和LC3 II/I比值的时间依赖性增加。用3-MA抑制自噬有效消除了缺氧诱导的DDP耐药性。这些发现与临床观察一致，即缺氧在NSCLC中普遍存在，并能激活多种促存活通路。

未折叠蛋白反应(UPR)的组分在癌症中经常过度表达，UPR相关因子正在成为潜在的治疗靶点。EIF2AK3(PERK)作为核心UPR调节因子，已在多种癌症类型中被涉及化疗耐药性。本研究中，EIF2AK3表达在NSCLC细胞中被缺氧以时间依赖性方式显著诱导。体外实验证明，EIF2AK3敲增强常氧条件下的DDP细胞毒性，并减弱缺氧诱导的自噬和DDP耐药性。在体内，A549异种移植中EIF2AK3的敲减导致更小的肿瘤和增强的对DDP化疗的反应性。

关于机制方面，研究聚焦于PI3K/AKT信号通路，这是癌细胞自噬调节的成熟途径。PI3K磷酸化AKT，进而调节多个控制细胞存活、增殖和凋亡的下游靶点。尽管mTOR参与感知细胞外信号如营养素、能量和生长因子，并调节包括蛋白质合成、核糖体生物发生和程序性细胞死亡在内的过程，但结果表明EIF2AK3主要通过PI3K/AKT信号调节自噬，而不依赖mTOR。EIF2AK3过表达增强自噬流，表现为LC3-II/I比值增加，同时伴随PI3K/AKT激活，而mTOR磷酸化与自噬变化不一致相关。这看似矛盾，因为典型mTOR激活主要通过磷酸化ULK1 Ser757抑制自噬。尽管本研究未评估ULK1 Ser757磷酸化，但先前报告证明EIF2AK3(PERK)可以通过mTOR非依赖机制诱导自噬。这是通过PERK-eIF2α-ATF4信号轴发生的，该轴转录上调自噬相关基因（如ATG5、BECN1、LC3），并能调节AMPK活性，从而在mTOR信号活跃的情况下促进自噬。

在救援实验中，雷帕霉素处理不仅恢复自噬标志物，而且部分逆转了EIF2AK3敲减在缺氧条件下诱导的p-mTOR抑制。这一观察与经典理解相矛盾，即雷帕霉素抑制mTOR活性以诱导自噬。然而，通过蛋白质印迹检测的mTOR磷酸化水平可能不能完全反映其激酶活性或功能状态，因为不同的磷酸化位点发挥不同的调节效果。此外，在缺氧条件和EIF2AK3缺陷下，复杂的反馈环或补偿信号可能导致p-mTOR水平的瞬时或环境依赖性变化。

总之，该研究证明缺氧诱导的自噬是驱动NSCLC细胞DDP耐药性的关键机制。EIF2AK3主要通过激活PI3K/AKT信号通路介导这一反应，不依赖mTOR，在体外和体内均如此。虽然mTOR磷酸化在缺氧条件下表现出复杂和环境依赖性的调节，但PI3K/AKT轴仍然是EIF2AK3促进自噬和化疗耐药性的一致下游效应器。靶向EIF2AK3及其PI3K/AKT介导的自噬通路代表了克服DDP耐药性和改善NSCLC患者治疗结果的有前景的策略。