6-硫代脱氧鸟苷通过诱导非生产性停滞端粒酶复合物抑制癌细胞端粒延伸的机制研究

《Nature Communications》：Therapeutic 6-thio-deoxyguanosine inhibits telomere elongation in cancer cells by inducing a non-productive stalled telomerase complex

本研究揭示了抗癌核苷类似物6-thio-dG通过诱导端粒酶形成非生产性停滞复合物，而非使其从端粒解离，从而特异性抑制癌细胞端粒维持的新机制。该发现阐明了6-thio-dG靶向端粒酶独特催化循环（如易位过程）的作用方式，为开发选择性靶向端粒酶的抗癌疗法提供了重要理论依据。

　　

在追求永生的征途上，癌细胞有一个致命的“阿喀琉斯之踵”——它们必须解决染色体末端的“保护帽”即端粒（Telomere）随着每次细胞分裂而缩短的问题。超过85%的癌细胞通过重新激活端粒酶（Telomerase）来维持端粒长度，从而实现无限增殖。然而，大多数正常体细胞不表达端粒酶，这使得端粒酶成为一个极具吸引力的抗癌靶点。尽管靶向端粒酶的抗癌策略被探索多年，但如何实现高效且特异性地抑制癌细胞中的端粒酶，同时避免对正常细胞的毒性，一直是领域内的核心挑战。

近年来，一种名为6-硫代-2'-脱氧鸟苷（6-thio-2'-deoxyguanosine, 6-thio-dG，也称为THIO）的核苷类似物在临床前研究中显示出良好的抗肿瘤效果，它能导致端粒酶阳性的癌细胞中端粒缩短和功能障碍。然而，6-thio-dG究竟是如何精确靶向并抑制端粒酶的，其分子机制一直模糊不清。是简单地作为“终结者”掺入DNA后引发损伤，还是有其更精巧的“锁死”机制？这个问题亟待解答。

为了揭开这一谜团，由Samantha L. Sanford、Mareike Badstübner等来自多所研究机构的研究人员组成的团队，在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们综合运用生物化学、生物物理学和细胞生物学等多种技术手段，深入探究了6-thio-dG抑制端粒酶的分子机理及其在癌细胞中的生物学效应。

研究人员主要运用了以下关键技术：体外端粒酶活性测定（使用从人细胞中免疫纯化的端粒酶）、DNA聚合酶δ（Pol δ）全酶进程性分析、电泳迁移变动分析（EMSA）、基于光学镊子的单分子结合动力学分析（C-Trap）、单分子荧光共振能量转移（smFRET）实时监测端粒酶催化动力学、利用表达模板序列突变hTR（C50/56A）的HCT116细胞模型检测细胞内新生端粒合成、以及基于超端粒酶（super-telomerase）的293T细胞快速端粒延长分析。此外，还通过集落形成实验、中期染色体荧光原位杂交（FISH）定量分析端粒长度和功能障碍（如端粒缺失、脆弱端粒和DDR+端粒）等经典细胞生物学方法评估6-thio-dG的长期效应。

Telomerase insertion of 6-thio-dGTP strongly inhibits repeat addition processivity

研究人员首先在体外重现了6-thio-dGTP对端粒酶的强烈抑制。即使在存在端粒酶进程性辅助因子POT1-TPP1（ Shelterin复合体的组成部分，能显著刺激端粒酶活性）的情况下，6-thio-dGTP仍然能有效抑制端粒酶的重复序列添加进程性（RAP），其半抑制浓度（IC₅₀）在微摩尔级别。这表明在细胞环境下，即使有 Shelterin 蛋白的存在，6-thio-dG也具有强大的端粒酶抑制潜力。

6-thio-dGTP fails to inhibit replicative DNA polymeraseδ holoenzyme

为了验证6-thio-dGTP对端粒酶抑制的特异性，研究团队测试了它对人体内负责基因组复制的关键酶——DNA聚合酶δ（Pol δ）全酶的影响。结果表明，即使使用生理浓度的dNTPs，用6-thio-dGTP替代dGTP对Pol δ的核苷酸添加进程性（NAP）仅产生轻微影响，并未造成显著抑制。这强有力地说明6-thio-dGTP对端粒酶的抑制作用是相对特异的，并非对所有DNA聚合酶都有普遍毒性。

Telomerase retains binding to 6-thio-dG containing telomeric DNA

一个关键的发现是，端粒酶能够结合到已含有6-thio-dG的端粒DNA上。通过EMSA和单分子光学镊子（C-Trap）结合实验，研究人员发现，无论端粒DNA引物的3’末端是正常的dG还是6-thio-dG，端粒酶与它们的结合亲和力没有显著差异。这意味着6-thio-dG的抑制作用并非通过阻止端粒酶与端粒的初始结合来实现。

Telomerase 6-thio-dGTP addition inhibits repeat addition processivity but not enzyme-DNA binding dynamics

那么，抑制究竟发生在哪一步？研究人员利用先进的单分子FRET（smFRET）技术，实时观察了单个端粒酶分子在合成端粒DNA时的动态过程。在正常dNTPs存在下，端粒酶合成DNA时会逐渐远离固定在DNA上的荧光基团，导致FRET效率从高向低转变，这表明酶在DNA上移动并合成多个重复序列。然而，当dGTP被6-thio-dGTP替代或存在过量6-thio-dGTP时，绝大多数端粒酶-DNA复合物停滞在高FRET状态，仅能观察到瞬时的、不稳定的低FRET波动，无法实现向稳定低FRET状态的转变。这表明端粒酶能够成功掺入6-thio-dGTP并完成第一个重复序列的合成，但在随后的“易位”（Translocation）步骤中受阻，无法重新启动新一轮的合成，从而形成了一个与端粒DNA结合但“停滞”的、无生产力的复合物。

Cellular 6-thio-dG treatment inhibits telomerase synthesis of telomeric DNA

接下来，研究在细胞水平验证了这一机制。他们设计了一个巧妙的实验：在HCT116癌细胞中引入一种模板序列发生突变（C50/56A hTR）的端粒酶，这种突变端粒酶会在端粒末端添加一种独特的、可被特异性探针识别的“变异”重复序列。这样，就可以直接监测细胞内由端粒酶新合成的端粒DNA，而不受庞大基因组背景的干扰。结果显示，用6-thio-dG处理细胞后，新生端粒信号（变异焦点数量和总强度）呈剂量依赖性显著降低，这直接证明了6-thio-dG在活细胞内有效抑制了端粒酶介导的端粒合成。这种抑制并非由细胞生长减慢或衰老所引起。

Cancer cells with critically short telomeres are hypersensitive to 6-thio-dG

最后，研究探讨了6-thio-dG对不同癌细胞的选择性毒性。他们发现，端粒酶阳性且拥有极短端粒（~3.7 kb）的HeLa VST细胞，对6-thio-dG的敏感性显著高于端粒较长（~27 kb）的HeLa LT细胞，也高于不依赖端粒酶的ALT通路阳性细胞U2OS。长期低剂量6-thio-dG处理会选择性地在端粒较短的HeLa VST细胞中诱导端粒缺失（染色体末端无端粒信号），并在两种细胞中增加端粒脆弱性和DDR+端粒（即功能失调的端粒）的比例，同时引起端粒缩短。这符合“端粒危机”理论：那些端粒已处于临界短状态的癌细胞，更依赖于端粒酶的持续活化来维持生存，因此对端粒酶抑制更为敏感。

综上所述，本研究揭示了6-thio-dG抑制端粒酶的全新分子机制：它并非简单地导致酶从DNA上脱落，而是在被端粒酶掺入端粒末端后，特异地干扰了端粒酶催化循环中至关重要的“易位”步骤，使其形成一个结合但“停滞”的非生产性复合物，从而阻止了后续端粒重复序列的添加。这种机制利用了端粒酶不同于常规DNA聚合酶的独特催化特性，可能解释了其相对特异性。

这项研究的意义重大。首先，它阐明了6-thio-dG（THIO）作为一种有前景的抗癌候选药物的作用机理，为其进一步的临床开发提供了坚实的理论基础。其次，研究强调了端粒长度是决定癌细胞对6-thio-dG敏感性的关键因素，这为患者分层和个性化治疗提供了潜在生物标志物。此外，研究揭示的“停滞复合物”机制为设计其他靶向端粒酶易位过程的新型抑制剂开辟了新思路。最后，该研究也对理解硫嘌呤类药物（如6-巯基嘌呤）在免疫抑制治疗中可能存在的、通过影响免疫细胞端粒维持而产生的长期副作用提供了新的视角。

总之，这项工作不仅解答了一个重要的基础科学问题，而且对转化医学具有重要意义，展示了通过深入理解酶学机制来推动靶向癌症治疗发展的强大力量。