EP300缺陷通过复制叉保护障碍诱发慢性复制应激并模拟BRCA缺陷癌症特征

《Nature Communications》：EP300 deficiency leads to chronic replication stress mediated by defective replication fork protection

本研究针对EP300突变在血液恶性肿瘤中的作用机制不明问题，通过ATLL患者来源细胞模型和EP300特异性降解剂，首次揭示EP300缺失通过下调BRCA2蛋白（非转录水平）导致复制叉保护缺陷，引发基因组不稳定性，并证实EP300突变细胞对PARP抑制剂敏感，为靶向治疗提供新策略。

　　

在血液恶性肿瘤中，EP300/KAT3B及其同源蛋白CBP/KAT3A的功能缺失突变日益受到关注，但EP300独立调控DNA复制稳定性的机制仍属未知领域。成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATLL）患者生存期极短，其中北美ATLL（NA-ATLL）患者中20%存在EP300突变且预后更差，这促使研究人员深入探索EP300缺陷如何驱动基因组不稳定性。传统研究多将EP300与CBP作为整体功能单元探讨，或聚焦于DNA损伤应答环节，而EP300在复制叉稳定性维持中的直接作用尚未被系统揭示。复制应激作为基因组不稳定的主要诱因，其解决机制依赖ATR/Chk1信号通路激活、RAD51介导的复制叉逆转及BRCA1/BRCA2/PALB2等下游效应蛋白的协同保护。尽管EP300被报道可转录激活BRCA1和RAD51促进同源重组，但其在复制应激下维持复制叉完整性的功能仍待阐明。本研究通过独特的EP300突变ATLL细胞模型和新型EP300特异性PROTAC降解剂JQAD1，首次系统阐释了EP300缺陷通过破坏复制叉保护导致慢性复制应激的分子通路，相关成果发表于《Nature Communications》。

研究关键技术包括：利用北美和日本来源的EP300野生型/突变型ATLL患者细胞系构建模型体系；应用EP300特异性降解剂JQAD1进行功能验证；通过单分子DNA复制分析（SMARD）技术解析脆弱位点复制动态；采用DNA纤维分析评估全基因组复制叉停滞及核酸酶降解；通过非变性条件免疫荧光检测单链DNA缺口；结合免疫印迹、细胞流术及RNA测序等多维度手段验证表型与机制。

EP300缺失改变组蛋白乙酰化与转录程序

研究人员比较了EP300野生型（NA1、NA4）与突变型（NA2、NA3）NA-ATLL细胞，发现突变型细胞EP300蛋白表达显著缺失，而CBP蛋白水平未受影响。JQAD1介导的EP300降解可特异性降低组蛋白H3K27ac修饰水平，并引起转录谱重编程，证实EP300功能丧失直接影响表观遗传调控。

EP300突变细胞呈现S期动力学延迟

细胞倍增时间分析显示EP300突变细胞分裂周期延长至40小时（野生型为20小时），流式细胞术检测发现突变细胞S期比例增加2倍，JQAD1处理野生型细胞可重现该表型，表明EP300缺失导致复制进程受阻。

EP300缺陷细胞存在自发DNA损伤且对外源复制应激敏感

免疫荧光检测发现突变细胞自发γH2AX焦点数量显著增加，复制抑制剂Aphidicolin（APH）或羟基脲（HU）处理加剧DNA断裂。碱性彗星实验进一步验证突变细胞DNA损伤程度更高。检查点激活分析显示突变细胞持续高表达pATR和pRPA^Ser4/8，且损伤修复延迟，伴随自发凋亡增加及HU诱导的凋亡加剧。

EP300突变细胞在CFS位点呈现异常复制动态

通过SMARD技术分析常见脆弱位点FRA6E的复制模式，发现突变细胞中休眠复制起点激活频率显著升高，复制暂停现象加剧。JQAD1处理可诱导野生型细胞出现类似复制扰动，证明表型由EP300缺失直接驱动。

EP300缺陷导致全基因组复制停滞与复制叉崩溃

DNA纤维实验显示突变细胞在HU处理下复制叉停滞程度更严重，且出现明显的新生链核酸酶降解现象。非变性免疫荧光检测证实突变细胞中单链DNA（ssDNA）缺口和pRPA^Ser4/8焦点累积，提示复制叉崩溃。Mre11抑制剂Mirin和DNA2抑制剂C5处理可逆转ssDNA积累，表明核酸酶过度活化是缺口形成的主因。

EP300缺陷细胞存在复制叉重启机制障碍

免疫印迹分析揭示突变细胞BRCA2蛋白表达显著下调，而BRCA1和RAD51蛋白水平无变化。免疫荧光显示APH处理后突变细胞BRCA2焦点招募减少，RAD51核丝形成受损。RNA测序证实BRCA2转录水平未受影响，提示蛋白质下调发生于转录后环节。

错误倾向修复机制在EP300突变细胞中上调

突变细胞中POLD3焦点（微同介导断裂诱导修复标志）增加，而PALB2招募在APH处理后减少，表明细胞倾向于使用易错修复机制。Mre11抑制可降低POLD3焦点数量，验证了错误修复与核酸酶活性的关联。

EP300缺陷细胞对PARP、POLθ和Rev1抑制剂敏感

凋亡实验显示突变细胞对PARP抑制剂Olaparib、POLθ抑制剂ART558和Rev1抑制剂JHRE06敏感性显著高于野生型，联合用药进一步增强杀伤效果，提示靶向DNA损伤耐受通路是潜在治疗策略。

EP300缺陷细胞存在复制不全DNA及G1期遗传性损伤

有丝分裂细胞中FANCD2双焦点（指示未完全复制区域）在突变细胞中自发增加，但EdU标记的MiDAS（有丝分裂DNA合成）未显著增强。微核分析显示突变细胞的微核中pRPA和FANCD2信号富集，G1期细胞53BP1核体数量增多，证实复制缺陷导致染色体错误分离及损伤代际遗传。

本研究首次阐明EP300通过调控BRCA2蛋白稳定性（非转录途径）维护复制叉完整性的新机制，揭示了EP300突变细胞与BRCA缺陷肿瘤的相似性：复制起点异常激活、复制叉降解、ssDNA缺口累积及易错修复依赖。这些发现不仅解释了EP300突变肿瘤基因组不稳定的驱动因素，更通过药物敏感性实验提供了PARP抑制剂、POLθ抑制剂等靶向治疗的理论依据。尽管EP300与CBP功能重叠性长期困扰领域研究，本研究利用患者特异性细胞模型和高选择性降解工具，清晰剥离出EP300独立功能，为开发EP300突变恶性肿瘤的精准疗法开辟了新路径。未来需进一步探索EP300调控BRCA2翻译后修饰的具体机制，并在体内模型中验证联合靶向策略的临床转化潜力。