羧甲基胞嘧啶：一种天然碱基修饰及其作为噬菌体DNA超修饰手柄的发现

《Nature Communications》：Carboxymethylcytosine is a natural base modification and a handle for bacteriophage DNA hypermodification

本研究针对噬菌体DNA修饰多样性及其逃避宿主免疫防御机制的科学问题，系统解析了噬菌体S-B43中新型DNA修饰系统CmoA-CmoX-CmoY的功能机制。研究发现羧甲基胞嘧啶(5cxmC)是天然存在的DNA碱基修饰，其通过噬菌体编码的羧基-S-腺苷甲硫氨酸(Cx-SAM)合成酶CmoA和DNA胞嘧啶C5-羧甲基转移酶CmoX协同催化形成，并进一步被酰胺连接酶CmoY介导甘氨酸连接形成5-甘氨酰羧甲基胞嘧啶(5gcxmC)。该研究通过晶体结构解析揭示了CmoX识别Cx-SAM的关键精氨酸残基作用机制，并通过生物信息学分析证实该修饰系统在噬菌体中广泛存在，为DNA表观遗传修饰研究开辟了新方向。

　　

在微生物世界的军备竞赛中，噬菌体与宿主细菌之间持续上演着精彩的攻防对抗。为了逃避细菌的限制性内切酶防御系统，噬菌体进化出了多种多样的DNA修饰策略，这些化学修饰如同给DNA穿上了"迷彩服"，使噬菌体基因组能够成功躲过宿主免疫系统的识别。然而，自然界中仍存在大量功能未知的噬菌体编码酶，它们可能参与着尚未被发现的DNA修饰途径。

近期发表在《Nature Communications》的一项突破性研究，由天津大学张雁教授团队联合上海交通大学、中国海洋大学等多个研究机构合作完成，首次发现羧甲基胞嘧啶(5-carboxymethylcytosine, 5cxmC)是一种天然存在的DNA碱基修饰，并揭示了其作为噬菌体DNA超修饰关键手柄的重要功能。该研究不仅重新定义了对DNA修饰多样性的认识，更为DNA合成生物学和表观遗传学研究提供了新的工具和思路。

研究人员主要运用了蛋白质晶体结构解析、液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术、纳米孔单分子测序、生物信息学分析等关键技术方法。其中噬菌体样本来源于海洋蓝藻噬菌体S-B43，通过培养扩增和基因组提取获得研究材料。

研究结果：

噬菌体中CmoA同源酶的鉴定与功能验证

通过基因组分析，研究团队在聚球藻噬菌体S-B43中发现了一个与大肠杆菌tRNA修饰酶CmoA同源的基因，但其基因组环境却包含DNA胞嘧啶甲基转移酶同源物(命名为CmoX)和天冬酰胺合成酶同源物(命名为CmoY)。这种独特的基因排列提示可能存在一个全新的DNA修饰系统。研究人员通过异源表达和纯化这些蛋白，为后续生化分析奠定了基础。

SpCmoA是高活性的Cx-SAM合成酶

实验证实噬菌体编码的SpCmoA能够以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和预苯酸为底物，高效合成羧基-S-腺苷甲硫氨酸(carboxy-S-adenosylmethionine, Cx-SAM)。液相色谱-质谱分析显示，SpCmoA的催化效率(k_cat=2.33 s^-1)显著高于大肠杆菌同源酶(EcCmoA, k_cat=0.23 s^-1)，这表明噬菌体可能通过优化酶活性来满足全基因组修饰的需求。

SpCmoX是DNA胞嘧啶C5-羧甲基转移酶

研究发现SpCmoX能够以Cx-SAM为共底物，在DNA的特定位点引入羧甲基，形成5-羧甲基-2'-脱氧胞苷(5cxmdC)。限制性内切酶实验表明，这种修饰能够保护DNA免受HhaI内切酶的切割。通过在大肠杆菌系统中进行体内重构实验，研究人员进一步证实了细菌源的CmoA能够为噬菌体CmoX提供所需的Cx-SAM。

纳米孔测序鉴定GC模体为修饰靶点

利用牛津纳米孔测序技术对噬菌体S-B43基因组进行分析，发现修饰主要发生在高度保守的GC序列模体中。通过合成不同序列的双链DNA底物进行验证，确认GC模体是SpCmoX识别和催化所必需的序列特征。

SpCmoX与Cx-SAM复合物的晶体结构

SpCmoX与Cx-SAM复合物的晶体结构解析至1.9埃分辨率，揭示了其与其他DNA胞嘧啶甲基转移酶相似的β/α-桶状折叠结构。关键发现是Arg-350残基与Cx-SAM的羧甲基基团直接相互作用，这一特征与之前报道的工程化甲基转移酶M.MpeI N374K变体相似，但SpCmoX表现出互补的序列特异性，主要识别GC模体。

SpCmoY催化DNA 5cxmC与甘氨酸的连接

研究发现SpCmoY是一种ATP依赖的酰胺连接酶，能够将甘氨酸连接到5cxmC的羧基上，形成5-甘氨酰羧甲基胞嘧啶(5gcxmC)。体内共表达实验和体外酶活测定均证实了这一转化过程，揭示了DNA超修饰的新机制。

天然噬菌体基因组中的5gcxmC修饰分析

对天然噬菌体S-B43基因组的直接分析证实了5gcxmC修饰的存在，估计约10%的胞嘧啶和75%的GC序列被修饰，证明了这一修饰系统的生物学相关性。

CmoX和CmoY同源酶的生物信息学分析

通过生物信息学分析，在噬菌体基因组中鉴定了5,615个CmoX同源序列和2,251个酰胺连接酶同源序列，表明这种DNA修饰-超修饰系统在噬菌体中广泛存在。序列相似性网络分析揭示了这些酶的序列多样性和可能的底物特异性差异。

研究结论与意义：

这项研究首次揭示了5cxmC是一种天然存在的DNA碱基修饰，并阐明了其在噬菌体DNA超修饰中的核心作用。与传统的甲基化修饰不同，羧甲基化引入了一个反应性羧基手柄，为后续的超修饰提供了可能性，这种策略类似于先前工程化方法中使用的前点击化学手柄。

该发现的重要意义体现在多个层面：首先，它扩展了我们对DNA化学多样性的认识，揭示了自然界中存在的DNA修饰机制比预期更为复杂；其次，噬菌体通过"招募"宿主RNA修饰机器来扩展自身DNA修饰库的策略，为理解病毒-宿主协同进化提供了新视角；第三，这一系统在合成生物学中具有广泛应用前景，包括DNA标记、测序技术和转录调控等领域。

特别值得注意的是，CmoX介导的全基因组修饰为逃避限制系统提供了新机制，而通过工程化改造这些酶，可能实现位点特异性的DNA修饰。虽然目前尚未发现与CmoA相关的腺嘌呤N6-或胞嘧啶N4-羧甲基转移酶，但理论上是可通过酶工程实现的。此外，对连接酶进行工程化改造以接受更广泛的胺底物，将有望在DNA治疗和化学生物学中实现多样化功能基团的引入。

这项研究不仅解决了一个基础科学问题，更重要的是为DNA功能化提供了新的工具和思路，有望在生物技术、医学诊断和治疗等领域产生深远影响。