CD44交联通过调控红细胞膜重塑与信号转导促进恶性疟原虫入侵的机制研究

《Nature Communications》：CD44 cross-linking promotes Plasmodium falciparum invasion

本研究针对恶性疟原虫入侵红细胞的分子机制这一关键科学问题，通过前沿的遗传筛选技术发现CD44是疟原虫入侵的重要宿主因子。研究人员创新性地揭示了一种独特的促进入侵机制：CD44交联（通过特异性抗体BRIC 222或疟原虫配体EBA-175实现）能够改变红细胞细胞骨架蛋白磷酸化状态，增加关键入侵受体Basigin的可及性，从而显著增强PCRCR/PfRH5复合物与红细胞的结合能力。这项发表于《Nature Communications》的研究首次阐明了CD44作为协同受体在疟原虫入侵过程中的核心调控作用，为理解宿主-病原体相互作用提供了新范式，并为抗疟药物研发提供了潜在新靶点。

　　

在人类与疟疾的漫长斗争中，恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）始终是最致命的威胁之一，每年导致数十万人死亡。这种单细胞寄生虫的致命性源于其独特的生存策略——入侵人体红细胞并在其中进行无性繁殖。每48小时，一个细胞内寄生虫就能产生多达32个子代裂殖子，这些新生的入侵者迅速突破宿主细胞，寻找新的红细胞目标，引发指数级增长的感染。然而，这个精密入侵过程背后的分子机制，特别是寄生虫如何巧妙利用宿主细胞表面分子完成入侵，仍是科学家们亟待破解的谜题。

传统的观点认为，疟原虫入侵是一个多步骤的线性过程，涉及寄生虫表面配体与红细胞受体的系列相互作用。其中，红细胞结合样（EBL）和恶性疟原虫网织红细胞结合样蛋白同源物（PfRH）家族的配体负责介导初始粘附、顶端重定向和红细胞膜变形，而PCRCR复合物（包括PfRH5、PfCyRPA、PfRIPR等）与红细胞表面Basigin（BSG）的结合被认为是入侵过程中唯一不可或缺的相互作用，这一步骤触发了棒状体分泌和移动连接结构的形成，是寄生虫成功进入宿主细胞的关键。

然而，这种简化的线性模型难以解释入侵过程中各步骤的精确协调性。更令人困惑的是，尽管研究人员已经发现了多个参与入侵的宿主因子，但针对这些因子的阻断抗体往往只能部分抑制入侵，暗示着可能存在更为复杂的调控网络。正是基于对这些未解之谜的探索，斯坦福大学医学院的Elizabeth S. Egan团队及其合作者开展了一项深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》期刊上。

研究人员首先通过一项创新的正向遗传学筛选，发现跨膜蛋白CD44是恶性疟原虫入侵的宿主因子。随后的验证实验表明，无论是通过shRNA敲低还是CRISPR/Cas9基因敲除技术构建的CD44缺失型红细胞，虽然能够正常分化和去核，但对恶性疟原虫入侵的敏感性显著降低。这一发现将CD44推向了疟原虫入侵研究的前沿，但一个关键问题随之而来：CD44究竟通过什么机制影响入侵过程？

为了回答这个问题，研究团队没有采用常规的基因敲除策略，而是另辟蹊径地选择了一组靶向CD44胞外域不同表位的单克隆抗体。令人意外的是，当他们在寄生虫入侵实验中加入这些抗体时，并没有观察到预期的入侵抑制效果。相反，一种名为BRIC 222的抗体展现出截然不同的作用——它显著促进了恶性疟原虫的入侵，最高可使入侵效率提高约80%，且这种促进作用呈现剂量依赖性。其他抗体如IM7仅产生轻微促进作用（约20%），而BRIC 235和KZ1则完全没有效果。

这一反常现象引发了研究人员的深入思考：BRIC 222为何会促进而非抑制入侵？通过比较完整BRIC 222抗体与其抗原结合片段（F(ab)）的效果，他们发现F(ab)片段即使在高浓度下也对入侵没有影响，这表明BRIC 222的促进作用依赖于CD44的交联，而非简单的表位结合。更重要的是，这种促进作用在不同地理来源、采用不同入侵途径的恶性疟原虫株系（3D7、W2mef、D10和7G8）中均得到验证，说明CD44交联促进入侵的现象具有株系跨越性。

与此同时，研究人员将目光投向了恶性疟原虫自身的入侵配体EBA-175。之前的研究已经表明EBA-175不仅与它的经典受体血型糖蛋白A（GYPA）结合，还能直接与CD44相互作用。当研究团队在入侵实验中加入EBA-175的重组RII区域（负责与红细胞结合的部分）时，他们观察到了与BRIC 222类似的现象——寄生虫入侵效率提高了约50%。这一发现将寄生虫自身的配体与CD44交联现象联系起来，暗示EBA-175可能在自然感染过程中扮演着CD44交联者的角色。

一个可能的解释是，BRIC 222和EBA-175通过诱导红细胞凝集（agglutination）来促进入侵，因为之前的研究表明EBA-175能够聚集未感染的红细胞，可能通过使红细胞更紧密地聚集在一起来促进裂殖子的重新入侵。然而，当研究人员仔细分析凝集细胞与单个细胞中的寄生虫感染率时，他们发现即使在没有发生凝集的单个红细胞中，入侵也同样被增强。更重要的是，另一种凝集素BRIC 224（靶向Luther血型抗原）虽然能引起剂量依赖性的红细胞聚集，却对寄生虫入侵没有影响。这些结果表明，红细胞凝集本身并不能完全解释CD44交联促进入侵的现象。

那么，CD44交联究竟通过什么机制促进入侵呢？研究人员从两个层面进行了深入探索：红细胞内部的信号转导和细胞表面的膜结构变化。

在信号转导层面，研究人员通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术分析了BRIC 222刺激后红细胞细胞骨架蛋白的磷酸化状态。结果显示，与不能引起交联的BRIC 222 F(ab)相比，完整BRIC 222抗体引起了多个细胞骨架蛋白磷酸化的显著变化。质谱分析鉴定出这些蛋白包括锚蛋白-1（ankyrin-1）、α和β血影蛋白（spectrin）、α内收蛋白（adducin）和带3蛋白（Band 3）——这些都是维持红细胞膜完整性和变形性的关键蛋白。这些发现表明CD44交联能够触发红细胞内部的信号转导，改变细胞骨架的物理特性，这可能为寄生虫入侵创造更有利的条件。

在细胞膜层面，研究人员通过流式细胞术检测了CD44交联对多种红细胞表面蛋白可及性的影响。令人惊讶的是，BRIC 222引起的CD44交联导致所有被测膜蛋白的表面检测信号增加，包括多个已知对入侵重要的蛋白（如Basigin、血型糖蛋白A和C）以及一些与入侵无关的蛋白（如CD47、SLC14A1和CD151）。此外，CD44交联还增加了磷脂酰丝氨酸（PS）的外化。这些结果表明，CD44交联引起了红细胞膜的全局性结构变化。

特别值得注意的是Basigin的变化，因为它是恶性疟原虫入侵的唯一已知不可或缺的受体。研究人员发现，CD44交联不仅增加了多克隆抗Basigin抗体的结合，还特别增强了单克隆抗体TRA-1-85的结合——这种抗体已知能够抑制寄生虫入侵。更重要的是，当研究人员直接检测PCRCR复合物与红细胞的结合时，他们发现BRIC 222引起的CD44交联使PCRCR结合平均增加了2.5倍。类似地，EBA-175刺激也使PCRCR结合平均增加了35倍，单独PfRH5的结合也增加了3.7倍。这些数据强有力地表明，CD44交联通过改变Basigin的构象或膜环境，增强了PCRCR/PfRH5与红细胞的相互作用，从而促进了入侵过程。

基于这些发现，研究团队提出了一个全新的模型：在自然感染过程中，恶性疟原虫通过其配体EBA-175（可能还有其他尚未鉴定的配体）交联红细胞表面的CD44。这种交联作用一方面触发红细胞内部的信号转导，改变细胞骨架的物理特性；另一方面引起红细胞膜的全局性结构变化，特别增加了Basigin受体的可及性。这两个方面的变化共同作用，显著增强了PCRCR复合物与Basigin的相互作用，从而协调了入侵过程中两个原本被认为相对独立的步骤——裂殖子顶端重定向（由EBA-175/GYPA相互作用介导）和棒状体分泌（由PCRCR/BSG相互作用触发）。

本研究的主要技术方法包括：利用培养红细胞（cRBCs）进行恶性疟原虫入侵实验；通过流式细胞术定量寄生虫入侵效率和红细胞表面蛋白表达；采用二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）和质谱分析检测蛋白质磷酸化变化；使用免疫荧光技术分析蛋白共定位；建立PCRCR/PfRH5结合实验评估配体-受体相互作用。研究所用红细胞样本来自斯坦福血液中心的匿名捐赠者。

研究结果部分，通过“CD44 cross-linking promotes Plasmodium falciparum invasion”实验发现，BRIC 222抗体通过交联CD44显著促进多种恶性疟原虫株系的入侵，且这种作用依赖于抗体的交联能力而非单纯结合。在“EBA-175 enhances invasion similarly to BRIC 222”中，研究人员证实疟原虫配体EBA-175也能类似地促进入侵，将寄生虫自身因子与CD44交联现象联系起来。“RBC agglutination induced by CD44 cross-linking is not directly correlated with invasion”实验排除了红细胞凝集作为主要机制的可能性，表明促进入侵的效果在凝集和非凝集细胞中均存在。

“CD44 cross-linking alters phosphorylation of RBC cytoskeletal proteins”部分揭示了CD44交联对红细胞内部信号的影响，发现多个细胞骨架蛋白的磷酸化状态发生改变。“CD44 cross-linking alters the RBC plasma membrane”实验证明CD44交联引起红细胞膜的全局性结构变化，增加多种表面蛋白的可及性。在“CD44 cross-linking enhances the accessibility of a Basigin epitope critical for invasion”中，研究人员特别关注了关键受体Basigin的变化，发现CD44交联增加了Basigin入侵表位的可及性，并直接证明这增强了PCRCR复合物与红细胞的结合。

研究的结论和讨论部分强调，这项工作不仅首次揭示了CD44交联在恶性疟原虫入侵中的促进作用，还阐明了其通过协调红细胞膜重塑和细胞内信号转导的双重机制。特别重要的是，研究将寄生虫配体EBA-175与CD44交联现象直接联系起来，为理解自然感染过程中宿主-病原体相互作用的动态调控提供了新视角。这项研究改变了人们对疟原虫入侵机制的传统认识，从将各入侵步骤视为相对独立的线性过程，转变为将它们视为一个通过CD44等协同受体精密协调的网络系统。这一新范式不仅深化了对疟疾发病机制的理解，也为开发针对宿主-病原体相互作用的新型抗疟策略提供了理论依据和潜在靶点。