多组学图谱揭示组织驻留微生物群如何影响结直肠癌进展与预后

《Nature Communications》：Tissue-resident microbiota impacts colorectal cancer progression and prognosis

本研究针对结直肠癌(CRC)组织微生物组低生物量研究的技术挑战，通过建立严格的分析流程，系统解析了937例患者的组织驻留微生物群特征。研究发现微生物组成与肿瘤解剖位置、分子亚型(CMS)和基因组特征显著相关，并构建了独立于临床因素的微生物风险评分(MRS)，为CRC预后预测和靶向干预提供了新视角。

　　

结直肠癌是全球第三大常见癌症和第二大癌症相关死亡原因，但其显著的异质性给风险分层和治疗优化带来了巨大挑战。除了宿主因素，肠道微生物组在结直肠癌发生发展中扮演着关键角色，如具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, Fn)、产肠毒素脆弱拟杆菌(enterotoxigenic Bacteroides fragilis, ETBF)和pks⁺大肠杆菌(pks⁺Escherichia coli)等已被证实可通过炎症诱导和DNA损伤促进肿瘤发生。然而，肿瘤组织低微生物生物量的特性使得准确区分真实微生物信号与污染物变得困难，加之测序深度不足、缺乏标准化分析流程等问题，限制了该领域研究的可重复性和跨队列可比性。近期一些肿瘤微生物组研究的重新评估甚至撤稿，凸显了在低生物量样本研究中实施严格污染控制和优先考虑特异性而非敏感性的分析框架的重要性。

为了深入解析结直肠癌组织驻留微生物组的异质性及其临床意义，由Zhun Shi、Huahui Ren、Cong Lin、Fuqiang Li等共同第一作者领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新成果。研究人员利用瑞典U-CAN前瞻性队列中937例初治结直肠癌患者的全基因组测序(WGS)和转录组数据，建立了一套严格的分析流程，系统描绘了组织驻留微生物群图谱，并揭示了其与肿瘤临床病理特征、基因组变异和患者预后的密切关联。

关键技术方法包括：利用高深度WGS(~52X)数据，采用两步法去除宿主序列，使用Kraken2和定制数据库（含UHGG基因组目录）进行微生物鉴定，并利用配对血液样本和已公布的污染物清单进行严格去污染，最终鉴定出249个属和361个物种作为可靠的结直肠癌组织驻留微生物群。研究队列包括乌普萨拉大学医院(UU)发现队列、于默奥大学医院(UM)内部验证队列以及AC-ICAM外部验证队列。

组织驻留微生物群的鉴定与验证

研究人员从1,412份组织样本（937个肿瘤和475个癌旁正常组织NATs）和462份血液样本中提取非人类序列，经过严格的质量控制和去污染步骤，成功鉴定出249个属和361个物种，构成了结直肠癌组织驻留微生物群的核心组成。与血液样本相比，肿瘤组织显示出显著更高的原核生物读长数和微生物基因组覆盖度，能够可靠地检测到已知的结直肠癌相关物种如脆弱拟杆菌、Prevotella nigrescens、大肠杆菌等。跨队列验证显示，三个肿瘤数据集（UU、UM、AC-ICAM）中前50个覆盖度最高的物种有27个重叠，证明了该方法的一致性和可靠性。

微生物组成随解剖位置和组织类型变化

研究发现，肿瘤解剖位置（左半结肠vs右半结肠）是导致组织驻留微生物组成差异的最强因素。右半结肠组织和肿瘤具有显著更高的原核读长数和更低的α多样性，且富含毛螺菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的成员；而左半结肠样本则富集肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、Akkermansia和Porphyromonas等 taxa。与配对的NATs相比，肿瘤表现出微生物多样性降低和组成改变，其中超过一半的肿瘤富集taxa显示出解剖位置特异性差异。值得注意的是，多个已明确的胃肠道癌症相关细菌（如四种Fn亚种、 Streptococcus anginosus、Clostridium bolteae等）在肿瘤中一致富集，且与解剖位置无关。

微生物群与体细胞突变的关联

研究团队分析了超突变(Hypermutated, HM)与非超突变(non-Hypermutated, nHM)肿瘤的微生物特征。发现26个肿瘤富集taxa在HM肿瘤中显著富集，包括四种Fn亚种和多种口腔来源taxa（如Treponema、A. tannerae等）。这些HM富集taxa与单核苷酸变异(SNV)数量呈正相关，并且在CRC驱动基因或DNA损伤修复(DNA damage response and repair, DDR)基因突变患者中丰度更高。特别值得注意的是，CASP8突变与最多数量的HM富集taxa相关。相反，APC突变或TP53等抑癌基因的杂合性丢失(Loss of Heterozygosity, LOH)事件与HM富集taxa（尤其是Fusobacterium spp.）的丰度降低相关。此外，研究在17.4%的UU肿瘤中检测到pks岛，其丰度与大肠杆菌丰度强相关，并且在左半结肠和nHM肿瘤中富集。pks⁺肿瘤中富集了已知的colibactin诱导特征SBS88以及两个未知病因的特征SBS93和ID14。

CMS分子亚型依赖的微生物特征及其预后意义

研究将肿瘤根据共识分子分型(Consensus Molecular Subtype, CMS)进行分类，并探讨了微生物特征的亚型特异性。与TCGA-COADREAD和AVANT队列的研究一致，四种Fn亚种和多种结直肠癌相关口腔taxa在CMS1肿瘤中显著富集。CMS2病例更年轻，更多位于左半结肠，绝大多数为nHM肿瘤，并且pks⁺比例更高。生存分析揭示，肠杆菌科taxa（如大肠杆菌）的高丰度以及pks⁺状态仅在CMS2患者中与较短的总生存期(Overall Survival, OS)和无复发生存期(Relapse-Free Survival, RFS)显著相关。相反，Fusobacterium仅在CMS4肿瘤中显示预后价值。机制上，在CMS2肿瘤中，大肠杆菌丰度与缺氧水平正相关，且只有CMS2 pks⁺肿瘤表现出显著更高的缺氧水平。在CMS4肿瘤中，Fn亚种与血管内皮生长因子(VEGF)和谷氨酰胺代谢通路正相关，但与免疫检查点（如PD1激活）、补体激活通路和多种免疫反应标志物负相关。

组织驻留微生物预测患者生存

研究分别在UU队列的肿瘤和NATs中鉴定出122个和34个与预后显著相关的taxa。大多数肿瘤来源的预后有利taxa（90.2%）与更长的OS相关，且主要富集于右半结肠组织，属于毛螺菌科和瘤胃球菌科。相反，少数不利预后taxa（如Clostridium bolteae等）与较差的OS相关。令人意外的是，在NATs中，Akkermansia muciniphila的高丰度（≥5%）与较差的预后显著相关，这一模式在验证队列中得到确认。基于预后taxa，研究人员构建了肿瘤微生物风险评分(Microbial Risk Score from Tumor, MRS-T)和癌旁组织微生物风险评分(MRS-N)。这两个评分高度相关，且都能独立预测患者的不良预后，并显著增强了仅基于宿主临床病理因素的预后模型的预测效能（C-index分别提高0.046和0.079）。进一步分析表明，有利预后taxa与缺氧、核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)信号等致癌通路的下调相关，而不利Clostridium taxa则与更高的缺氧、IL6和MAPK1/3激活水平相关。

本研究通过建立严谨的分析框架，深入揭示了结直肠癌组织驻留微生物群的异质性及其与肿瘤分子特征和患者预后的复杂相互作用。所构建的微生物风险评分(MRS)为超越传统临床病理因素的预后预测提供了新工具，并指出了基于微生物组的靶向干预潜在途径，例如针对CMS2患者中肠杆菌科或pks⁺菌株，或调控特定有益/有害微生物群。然而，研究也存在局限性，如低生物量限制了对低丰度细菌和非细菌微生物的解析，无法区分细胞内/外微生物，且未能评估癌症治疗对微生物的影响。未来研究需要借助高分辨率成像和空间转录组学等技术，并在实验模型中验证微生物的因果作用，以推动微生物组在结直肠癌精准医疗中的应用。