预存抗复制酶免疫对自扩增mRNA疫苗效力的影响及其机制研究

《Nature Communications》：Impact of pre-existing anti-replicase immunity on the efficacy of self-amplifying mRNA vaccines

本研究针对自扩增mRNA（saRNA）疫苗在重复接种时可能因预存抗病毒复制酶免疫而降低效力的问题，通过小鼠模型证实首次saRNA疫苗接种会诱导产生抗VEEV复制酶的抗体和T细胞，从而抑制后续saRNA疫苗的Th1细胞应答，但意外发现这种免疫抑制并不影响流感saRNA疫苗对H5N1病毒的攻击保护效果，为saRNA疫苗的序贯接种策略提供了重要理论依据。

　　

在疫苗研发领域，自扩增mRNA（self-amplifying mRNA, saRNA）技术近年来崭露头角，已有两款saRNA疫苗在印度、日本和欧盟获批上市，标志着该技术的重要突破。与传统mRNA疫苗相比，saRNA疫苗的特殊之处在于其编码了病毒复制酶，能够在细胞内自我扩增，从而以更低剂量实现有效免疫。然而，这种设计也带来了一个关键科学问题：疫苗编码的复制酶本身是否会像腺病毒（Adenovirus, Ad）或腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）载体疫苗的衣壳蛋白那样，引发针对疫苗平台本身的免疫反应？如果会，这种预存免疫是否会影响后续使用相同复制酶的同平台疫苗的效果？这个问题对于未来可能需要多次接种saRNA疫苗（如针对不同病原体或作为癌症疫苗）的应用前景至关重要。

为了回答这些问题，来自比利时根特大学等机构的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。研究人员以雌性BALB/c小鼠为模型，系统地探讨了预存抗复制酶免疫对saRNA疫苗表达、免疫原性及保护效力的影响。

研究团队运用了多项关键技术方法：他们设计并合成了多种基于委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan Equine Encephalitis Virus, VEEV）TC-83株的saRNA构建体（如编码荧光素酶的saRNA^Fluc、编码血凝素的saRNA^HA等）以及作为对照的非复制mRNA（modified mRNA），并通过脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）进行递送；利用体内生物发光成像技术动态监测saRNA在小鼠体内的表达 kinetics；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体滴度，通过流式细胞术分析抗原特异性T细胞反应；采用被动血清和T细胞转移实验验证不同免疫成分的作用；并最终在H5N1流感病毒攻毒实验中评估疫苗的保护效果。

研究结果

自我扩增mRNAs引发针对复制酶的适应性免疫反应并影响后续saRNA的表达

研究人员首先给小鼠注射两次saRNA^Fluc-LNP（间隔3周），发现首次接种后即可检测到抗复制酶IgG抗体，加强免疫后抗体水平显著升高。同时，在脾细胞中检测到了复制酶特异性的IFN-γ⁺CD4⁺和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞。这表明saRNA疫苗接种确实能诱导针对复制酶的体液和细胞免疫。为了探究这种预存免疫对后续saRNA表达的影响，研究人员先用saRNA^HA-LNP预处理小鼠以诱导抗复制酶免疫，然后再注射saRNA^Fluc-LNP。与PBS预处理组相比，预存免疫组小鼠在注射后头两天内的荧光素酶表达较低，但出乎意料的是，从第14天起，其表达水平反而高于对照组。此外，预存免疫还降低了后续saRNA^Fluc所编码的弱抗原（荧光素酶）的抗体应答，并提高了IgG1/IgG2a比值，提示Th1免疫应答受到抑制。

由首次saRNA疫苗接种计划产生的预存抗复制酶免疫降低了后续saRNA疫苗接种计划的抗原特异性T细胞反应

接下来，研究团队模拟了序贯接种场景：小鼠先接受两剂saRNA^Fluc-LNP（首次接种计划），然后在不同间隔时间（2、4、8周）后，再接受两剂saRNA^HA-LNP（第二次接种计划）。结果显示，无论间隔时间长短，预存抗复制酶免疫均显著削弱了第二次接种计划所诱导的HA特异性IFN-γ⁺CD4⁺和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞反应，但对抗HA IgG抗体水平没有显著影响。抗复制酶抗体水平在首次接种计划后8周内保持稳定，这可能是延长间隔时间未能恢复T细胞应答的原因。

仅低水平的预存抗复制酶T细胞不会损害后续saRNA疫苗的T细胞反应

为了区分抗体和T细胞在免疫抑制中的作用，研究人员使用了不同的预处理策略：saRNA（诱导高水平的抗体和T细胞）、编码复制酶的非复制mRNA（mRNA^Rep，仅诱导低水平的T细胞反应）等。结果发现，只有预处理能同时诱导高水平抗复制酶抗体和T细胞（如saRNA^Fluc或saRNA^Rep）时，才会显著抑制后续saRNA^HA疫苗的T细胞应答。而仅诱导低水平T细胞（如mRNA^Rep预处理）则无此抑制作用。在IFN-β报告基因小鼠中的实验进一步表明，预存saRNA免疫可能会降低后续saRNA疫苗接种部位的IFN-β表达，这可能是抑制T细胞应答的另一个因素。

当抗复制酶抗体和T细胞同时存在时，对saRNA疫苗T细胞反应的抑制最强

通过被动转移实验，研究人员将来自抗复制酶免疫小鼠的血清、T细胞或两者同时过继转移给初始小鼠，然后进行saRNA^HA疫苗接种。结果显示，只有同时转移血清和T细胞才会显著降低HA特异性T细胞反应。单独转移血清或T细胞仅引起不显著的轻微下降。这证实了抗复制酶抗体和T细胞在抑制后续saRNA疫苗T细胞应答中存在协同作用。

用高剂量saRNAFluc预处理小鼠会损害后续saRNAHA疫苗的细胞和体液反应

当首次接种计划使用更高剂量（4μg）的saRNA^Fluc-LNP时，预存抗复制酶免疫对后续saRNA^HA疫苗的抑制作用更为明显，不仅影响了T细胞应答，还在初次免疫后显著降低了抗HA抗体和血凝抑制（Hemagglutination Inhibition, HI）滴度。不过，在加强免疫后，抗体水平能够大幅提升并接近对照组。这提示加强免疫可以在一定程度上克服预存免疫对体液应答的抑制。研究还发现，当后续saRNA编码的抗原免疫原性较弱时（如荧光素酶），预存抗复制酶免疫的抑制效应更为显著。

预存抗复制酶免疫不会损害saRNA疫苗对H5N1流感病毒的保护效果

最后，也是最关键的，研究人员进行了攻毒实验。即使小鼠预先存在由高剂量saRNA^Fluc诱导的抗复制酶免疫，甚至只接种一剂saRNA^HA疫苗（其HI滴度在攻毒时检测不到），所有 vaccinated 小鼠均能完全抵抗致死剂量的H5N1病毒攻击，而未接种疫苗的小鼠全部死亡。这表明，尽管预存抗复制酶免疫会削弱某些免疫参数（特别是Th1细胞应答），但saRNA疫苗仍能提供强大的保护效力。

结论与意义

本研究首次系统地揭示了预存抗复制酶免疫对saRNA疫苗平台的影响。其主要结论是：saRNA疫苗接种会诱导产生针对其编码的病毒复制酶的适应性免疫应答；这种预存免疫会改变后续saRNA在体内的表达动力学，并显著抑制其诱导Th1细胞应答的能力，这种抑制是由抗复制酶抗体和T细胞协同介导的，且延长接种间隔（至多8周）或仅存在低水平T细胞免疫时无法逆转；当首次接种剂量较高时，预存免疫也会暂时影响后续疫苗的体液应答，但加强免疫可 largely 克服这一影响；最重要的是，在流感病毒攻毒模型中，这种免疫抑制并未转化为保护效力的下降。

这项研究对saRNA疫苗的未来应用具有重要指导意义。对于主要依靠抗体提供保护的传染病预防性疫苗，序贯使用基于相同复制酶的saRNA疫苗可能是可行的。然而，对于疗效高度依赖强效细胞免疫的疫苗，例如癌症疫苗（尤其是需要多次接种的新抗原疫苗），预存抗复制酶免疫的负面影响则需要慎重考虑。为了解决这一问题，未来可考虑在序贯接种中换用来自不同病毒（如塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒等）的复制酶，从而规避预存免疫的干扰。总之，该研究为优化saRNA疫苗的接种策略提供了关键的科学依据，推动了这一有前景的疫苗平台的发展。