《Cancer Letters》：BMP9 Potentiates Immunotherapy in Triple-Negative Breast Cancer by Suppressing Tregs Infiltration via the PRKDC-CCL2 Axis
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骨形态发生蛋白-9（BMP9）通过抑制CCL2表达和NF-κB信号通路，减少调节性T细胞浸润，协同免疫检查点抑制剂增强三阴性乳腺癌免疫治疗效果，并揭示BMP9-PRKDC-CCL2轴调控肿瘤-免疫微环境互作的关键机制。
尤一晴|韦兰|戴梦|赵国志|范坤|党婷婷|孙浩莉|张亮|李倩|孙梦欣|李晓璐|何曦然|杨世宇|曾涛|唐家峰|张艳
中国重庆医科大学实验医学系，教育部医学诊断重点实验室，重庆 400016
摘要
免疫疗法是治疗三阴性乳腺癌（TNBC）的关键策略，但其疗效受到肿瘤微环境（TME）免疫抑制作用的限制。在本研究中，我们发现骨形态发生蛋白-9（BMP9）能够抑制肿瘤生长并重新编程免疫TME，主要通过减少调节性T细胞（Tregs）的浸润来实现。Tregs的耗竭会消除BMP9介导的肿瘤抑制作用。机制上，BMP9以一种不依赖细胞外分泌的方式抑制CCL2的表达，从而限制Tregs的募集。我们确定DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（PRKDC）是BMP9的结合转录调节因子。PRKDC与BMP9的相互作用通过抑制PRKDC的磷酸化直接阻碍CCL2的转录激活，并通过NF-κB通路的重塑间接抑制CCL2的表达。重要的是，BMP9的调节作用和针对CCL2的治疗手段能够在不产生明显毒性的情况下增强免疫疗法的效果。我们的研究揭示了BMP9-PRKDC-CCL2轴作为TNBC与Tregs相互作用的主要调控节点，为克服TNBC对免疫疗法的耐药性提供了策略。
引言
乳腺癌（BC）仍然是全球女性癌症相关死亡的主要原因，给医疗系统带来了巨大负担，并影响了患者的长期生存。三阴性乳腺癌（TNBC）是最具侵袭性的分子亚型，约占所有乳腺癌病例的20%。TNBC具有早期复发、疾病进展加快以及向远处转移的倾向[1]、[2]。由于缺乏可靶向的药物，TNBC的治疗选择十分有限，传统的非特异性化疗（除了手术切除外）仍是主要的治疗手段，但临床效果并不理想[3]。由于肿瘤微环境（TME）的免疫抑制作用，免疫疗法的反应率较低。关键在于，免疫疗法需要一个免疫活性高的TME环境；那些具有高比例调节性T细胞（Tregs）浸润、PD-L1阴性或CD8+ T细胞功能耗竭的患者通常对免疫疗法无反应[4]。
转化生长因子-β（TGF-β）超家族包含结构保守的细胞因子，具有多种功能，是免疫反应的核心调节因子[5]。作为该超家族的关键成员，BMP9不仅促进新骨形成，还调控多种细胞过程，如血管生成、葡萄糖代谢和脂质稳态[6]。此外，BMP9通过刺激细胞因子分泌来促进中性粒细胞向炎症部位的募集[7]。值得注意的是，在类风湿性关节炎中，BMP9的沉默会通过扰乱微环境中的炎症介质而加速疾病进展[8]。我们之前的研究显示，BMP9通过Smad依赖性和非依赖性途径抑制肿瘤进展，同时通过抑制BC中的CCL2、CXCR4和IL6信号通路来调节抗肿瘤免疫[9]、[10]、[11]。因此，解析BMP9在TNBC中的免疫调节机制可能揭示免疫信号网络中的关键节点，为将其发展为治疗策略提供理论依据。
本研究证明内源性BMP9与免疫检查点抑制剂联合使用可显著增强TNBC的抗肿瘤效果。机制上，BMP9在肿瘤细胞中诱导DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（PRKDC）的去磷酸化，直接抑制CCL2的转录，并同时激活NF-κB通路以加强转录抑制。这种双重抑制作用减少了Tregs向肿瘤内的浸润。
抗体、抑制剂和试剂
用于免疫印迹实验的抗体包括：抗BMP9（ab207318，Abcam，Western Blot 1:2000；Anti-CCL2（ab214819，Abcam，Western Blot 1:2000，Immunofluorescence 1:2000，Immunohistochemistry 1:2000）；抗PRKDC（19983-1-AP，Proteintech，Western Blot 1:2000，Immunofluorescence 1:100）；抗p-PRKDC（HA722066，HUABIO，Western Blot 1:2000，Immunofluorescence 1:100，Immunohistochemistry 1:2000）；抗p65（ab32536，Abcam，Western Blot 1:2000）；抗p-P65（ab76302，Abcam，Western Blot 1:2000）；抗IKBα（ab32518，Abcam，Western Blot 1:2000）；抗p-IKBα（ab92700，Abcam，Western Blot 1:2000）。
BMP9抑制TNBC生长并重塑免疫TME
为了研究BMP9在TNBC中的功能作用，我们将过表达BMP9的4T1Luc细胞植入小鼠体内，建立了原位TNBC模型（图1A）。通过生物发光成像确认了肿瘤的成功植入（图1B）。BMP9显著减缓了肿瘤生长（图1C，D）并减少了肿瘤体积（图1E）。Ki-67和TUNEL检测显示BMP9抑制了肿瘤细胞增殖（图1F）并促进了细胞凋亡（图1G）。免疫组化分析进一步证实了这一效果。
讨论
免疫疗法通过激活TME中的免疫反应来增强特异性抗肿瘤免疫。PD-L1/PD-1单药治疗在BC患者中显示出良好的安全性和反应率[15]，而新辅助化疗联合免疫疗法显著改善了TNBC的临床效果[16]、[17]。高密度的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）预示着强大的抗肿瘤免疫能力，并与免疫疗法的效果相关。重要的是，Tregs（一种关键的免疫抑制性CD4+ T细胞亚群）会抑制CD8+ T细胞的功能。
CRediT作者贡献声明
赵国志：数据可视化、概念构思。韦兰：初稿撰写、数据可视化、概念构思。杨世宇：数据验证。戴梦：初稿撰写、数据可视化、概念构思。曾涛：数据验证。李晓璐：数据验证。尤一晴：初稿撰写、数据可视化、正式分析、概念构思。何曦然：数据验证、正式分析。李倩：数据验证、正式分析。孙梦欣：数据验证、正式分析。孙浩莉：数据验证、正式分析。张亮：数据验证。
数据获取
本研究生成的数据集可通过通讯作者（张艳教授）获取，需遵守合理的数据共享协议。
伦理审批和参与同意
本研究获得了綦江区人民医院伦理委员会的批准，允许收集和使用临床样本；同时获得了重庆医科大学伦理委员会的批准，允许进行动物实验。
利益冲突声明
所有作者均声明没有可能影响本研究结果的财务或个人利益关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（81974449）和重庆市教育委员会科技研究计划（KJQN202502726）的支持。
