从海洋宏基因组中鉴定和表征一种耐葡萄糖的耐热β-葡萄糖苷酶的计算方法

《Molecular Diversity》：Computational approach for identification and characterization of a glucose-tolerant thermostable β-glucosidase from marine metagenome

本研究通过海洋基因组挖掘，鉴定出GH1家族β-葡萄糖苷酶ECV39653.1，证实其具有高热稳定性（Tm>65℃）、强纤维素降解能力（kcat/Km=989.08 sec?1·mM?1）及低葡萄糖结合亲和力（结合能-5.4 kcal/mol），分子对接和MD模拟表明其复合物稳定性优异（平均结合能-17.45 kcal/mol），为生物燃料大规模生产提供新候选酶。

　　

摘要

纤维素酶包括内切-1,4-β-葡聚糖酶、外切-1,4-β-葡聚糖酶和β-葡糖苷酶，它们能够分解纤维素生物质，并常用于从木质纤维素中生产生物燃料。将纤维二糖转化为葡萄糖的β-葡糖苷酶对温度和葡萄糖浓度敏感，因此其催化效率往往较低。虽然已经评估了多种具有较高耐温性或耐葡萄糖性的β-葡糖苷酶，但至今尚未找到兼具高效性、热稳定性和耐葡萄糖性的理想候选酶。本研究通过海洋宏基因组分析来寻找具有高潜力的β-葡糖苷酶。共发现了9种属于GH 1家族的β-葡糖苷酶，这些酶都具有(β/α)₈桶状结构域。其中6种β-葡糖苷酶的熔解温度（Tm值）高于65℃，其中包括ECV39653.1 β-葡糖苷酶。通过分子对接实验发现，ECV39653.1 β-葡糖苷酶在活性位点对纤维二糖的结合能最低，为-7.4 kcal/mol；而在非活性位点对葡萄糖的结合能仅为-5.4 kcal/mol。结构分析表明，ECV39653.1 β-葡糖苷酶与已知的热稳定性和耐葡萄糖性β-葡糖苷酶具有较高的相似性。动力学参数预测显示，该酶对纤维二糖的催化速率常数（k_cat/K_m）为989.08163 sec^-1 mM^-1。深入的分子动力学模拟和自由结合能分析显示，在100纳秒的模拟时间内，该酶对纤维二糖的结合非常牢固，平均总结合能为-17.45 kcal/mol。主成分分析（PCA）和自由能景观分析表明，ECV39653.1 β-葡糖苷酶与纤维二糖形成的复合物在构象变化上比其游离态更稳定，且达到了全局能量最小值，进一步证明了该复合物的高稳定性。模拟轨迹分析还显示，葡萄糖在模拟过程中会离开结合腔，说明其结合力较弱，但具有较高的耐葡萄糖性。因此，这项基于计算机模拟的研究发现了一种高效、热稳定且耐葡萄糖的ECV39653.1 β-葡糖苷酶，为大规模生物燃料生产技术的开发提供了潜在的应用前景。