综述：基于黄酮类化合物的底涂剂应用于龋坏影响牙本质后对牙髓细胞的跨牙本质效应

《Clinical Oral Investigations》：Transdentinal effects of flavonoid-based primers applied to caries-affected dentin on pulp cells

本综述聚焦于黄酮类底涂剂（如柚皮苷、山奈酚、黄芩素）处理龋坏影响牙本质后，其成分经跨牙本质扩散对牙髓细胞的生物学效应。研究表明，这些底涂剂具有良好的细胞相容性，不仅能维持牙髓干细胞（DPSC）和成牙本质细胞样细胞（MDPC-23）的活力，还能促进矿化结节形成，并通过降低巨噬细胞（RAW 264.7）的活性氧（ROS）水平发挥抗氧化作用。这为开发既能增强牙本质-树脂粘接稳定性（如抑制基质金属蛋白酶MMPs），又能有益于牙髓健康的微创修复策略提供了实验依据。

　　

引言：牙本质粘接的挑战与黄酮类化合物的机遇

在修复牙科中，牙本质粘接始终是一项挑战，尤其是在牙本质被龋坏损害或使用磷酸进行酸蚀之后。这种复杂性主要源于牙本质固有的特性，如其富含胶原的有机组成和牙本质液的存在，这些都会阻碍粘接剂的渗透和聚合。此外，龋坏致病菌引起的胶原结构改变以及磷酸酸蚀都会激活基质金属蛋白酶（MMPs），导致胶原纤维降解，从而影响混合层的长期稳定性。同时，粘接树脂也可能发生水解降解，进一步降低粘接强度。这些因素的相互作用导致了修复体的失败，如边缘微渗漏和继发龋，缩短了复合树脂修复体的寿命。

为缓解酶促降解带来的损害并提高牙本质粘接稳定性，多种策略已被研究，其中之一便是使用基于天然产物的实验性底涂剂溶液。黄酮类底涂剂被提出作为牙本质生物改性步骤，前提是剩余牙本质厚度足够确保其安全使用。由于在深龋洞中直接应用粘接系统而不用洞衬剂或基底仍存争议，使用黄酮类底涂剂的主要目标是通过稳定牙本质基质来提升龋坏影响牙本质的质量，而不依赖于后续应用的材料。

黄酮类化合物凭借其抗氧化特性，已被证明能有效抑制MMPs的活性。此外，它们还能通过促进胶原纤维交联来增强牙本质的机械性能，有助于提高抗水解降解能力。先前的研究表明，黄酮类化合物在减少混合层降解方面表现出色。最近的研究强调了其在改善复合树脂修复体寿命方面的潜力，特别是在龋坏影响牙本质中，能稳定牙本质-粘接剂界面并预防继发龋。同时，黄酮类化合物可能在增强具有挑战性的龋坏影响牙本质的粘接强度方面发挥重要作用。

在龋坏影响牙本质中，羟基磷灰石晶体不完全溶解，有机基质完全或部分降解，牙本质小管可能因矿化管周牙本质减少而直径增大。这种脱矿作用导致的牙本质胶原结构改变增加了组织的通透性，便于底涂剂的扩散。磷酸酸蚀会加剧这种扩散，使得底涂剂和粘接材料能更深地渗透入牙本质，有可能到达牙髓细胞。这对牙本质-树脂粘接强度和预防复合树脂修复中的牙髓损伤具有重要意义。

除了对牙本质生物改性的作用，黄酮类化合物还表现出抗氧化和抗炎特性，这可能调节牙髓的免疫反应。巨噬细胞在牙髓细胞三级牙本质形成相关的再生反应所涉及的先天免疫炎症事件中起关键作用，并且是活性氧（ROS）释放及随后在牙本质-牙髓界面产生氧化应激的主要贡献者。因此，评估黄酮类底涂剂调节ROS产生的潜力，为了解其在深龋洞应用中可能带来的免疫调节益处提供了宝贵见解。此外，几种黄酮类化合物已被证明能影响牙髓干细胞（DPSCs）的成牙本质潜力，促进矿化结节形成并上调参与牙髓-牙本质复合体修复的标记物。这些生物学机制共同表明，黄酮类底涂剂不仅可能影响牙本质基质的质量，还可能影响牙髓细胞的行为和炎症调节，这为本研究评估细胞相容性、矿化潜力和ROS产生提供了依据。

材料与方法

黄酮类底涂剂的制备

研究选用了不同亚类的黄酮类化合物，包括黄芩素（Baicalein）、山奈酚（Kaempferol）和柚皮苷（Naringin）。根据先前研究，将这些化合物用分析天平精确称重，溶解于20%乙醇中。混合物在室温下于磁力搅拌器上搅拌24小时（避光），直至完全均质，得到最终浓度为20 mM的溶液。使用前，溶液经0.22μm膜过滤。所有溶液均在每次实验前新鲜配制，不储存。

使用微宇宙生物膜诱导龋坏

本研究获得了56颗健康人第三磨牙。所有牙齿经手工刮治和浮石粉抛光后，存储在0.5%氯胺-T水溶液中（4°C，不超过一个月）。去除牙合面釉质，暴露中深度牙本质（大约在釉质牙骨质界上方2mm）。牙本质表面用600目碳化硅纸水冷却下抛光5秒以形成平坦表面并标准化玷污层。牙齿釉质涂上指甲油，仅暴露牙本质，然后浸入生理盐水中在121°C高压灭菌15分钟以维持组织水合。先前研究表明，短周期湿热灭菌不会显著影响牙本质形态或化学成分，并已广泛用于龋坏生物膜微宇宙模型。

龋坏诱导采用多物种微宇宙生物膜法。将400μL唾液储备液加入不含唾液蛋白并补充了1%蔗糖的BHI培养基中，在CO₂培养箱中孵育24小时以进行活化。随后，将悬浮液与新鲜培养基按1:1比例混合，将牙本质样本单独放入24孔板中，在相同条件下再孵育24小时以形成唾液获得性膜。次日，吸出生长培养基，每个样本用1mL生理盐水轻轻冲洗两次。加入补充了1%蔗糖的新鲜培养基。此过程每天重复，持续七天，直至形成人工牙本质龋损。

制备龋坏影响牙本质

龋坏诱导后，使用标准化方案选择性去除感染和软化的牙本质层，即用320目碳化硅砂纸打磨60秒以去除外层感染牙本质，同时保留下层龋坏影响牙本质。随后，从龋坏样本制备0.5毫米厚的圆片，并使用圆柱形金刚砂钻头将其直径减小至8毫米。所有达到最终0.5毫米厚度所需的调整仅从髓腔侧进行，使用600目碳化硅砂纸在持续水冷却下进行，以确保龋坏影响表面不被改变。然后将样本调整至适合插入人工髓室（APC）的尺寸，使用橡胶环和蜡将样本固定在装置中，以密封可能允许底涂剂不通过牙本质扩散的任何空隙。

APCs制备后，将0.5 M EDTA（pH 7.4）应用于牙本质样本的牙合面和髓腔面60秒以去除玷污层，然后用水彻底冲洗。装有龋坏牙本质圆片的APC装置随后使用环氧乙烷进行灭菌，然后开始细胞实验。

细胞培养

研究使用了三种细胞类型以全面评估黄酮类底涂剂的生物学效应：鼠成牙本质细胞样细胞（MDPC-23）、人牙髓干细胞（DPSCs）和鼠巨噬细胞（RAW 264.7）。

MDPC-23细胞因其是表现成牙本质细胞样表型的成熟永生化细胞系而被选用。细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中维持，在37°C、5% CO₂下孵育。实验使用第4至8代细胞。

人牙髓干细胞（DPSCs）从Lonza公司获得，是从人第三磨牙分离的商业化原代DPSC群体，经预验证用于间充质干细胞标记物研究。DPSCs在补充有20% FBS、1%青霉素-链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的α-MEM中培养。细胞在37°C、5% CO₂下孵育，实验使用第3至8代细胞。

RAW 264.7鼠巨噬细胞被纳入以模拟先天免疫反应并评估经跨牙本质扩散提取物诱导的抗氧化调节作用。RAW 264.7细胞在补充有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中维持。细胞在37°C、5% CO₂下孵育，实验使用第5至11代细胞。

实验设计

将含有牙本质圆片的APC装置放入24孔板中，髓腔面朝上，在DMEM中水化24小时。此后，将MDPC-23细胞（3 x 10⁴个）接种到髓腔表面的DMEM培养基中（补充10%热灭活FBS、100 IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素）。在5% CO₂和37°C下孵育24小时后，更换为无血清DMEM，并将装置倒置以暴露牙合面。用35%磷酸酸蚀处理组（BA, KA, NA和SC）的牙本质被处理15秒，随后用无菌水冲洗并同时吸干，确保没有材料接触培养基。然后，将20μL处理溶液被动应用于样本的牙合面牙本质60秒。用吸水纸去除多余的底涂剂溶液，而只有附着细胞的髓腔面仍与培养基接触。对照组和实验组见表1。

牙本质处理后，平板再孵育24小时。此后，评估接种在髓腔表面的细胞活力，并使用扫描电子显微镜（SEM）分析细胞形态。收集与细胞接触并含有经牙本质扩散处理成分的培养基，用于对在平板中培养的MDPC-23、DPSC细胞和巨噬细胞（RAW 264.7）进行间接测试。这些测试评估了细胞活力、矿化和抗氧化潜力。

接种于牙本质上的MDPC-23细胞活力

应用处理24小时并收集含有提取物的培养基后，将带有牙本质圆片的APC装置重新放置，髓腔面朝上。小心去除髓腔面上残留的培养基，以避免干扰附着的细胞。制备10% alamarBlue溶液（溶于无FBS的DMEM中），将110μL该溶液添加到圆片的髓腔面。样本随后孵育3小时。在555 nm和595 nm波长下分析荧光强度。NC的平均荧光值被视为100%细胞活力，并用于计算其他处理的细胞活力值。对于SEM分析，随机选择APC装置（n=3），在2.5%戊二醛溶液中固定12小时，随后通过梯度乙醇系列（30%、50%、70%、90%和100%）脱水，每种浓度应用10分钟，接着再浸泡两次100%乙醇。脱水后，使用六甲基二硅氮烷（HMDS）化学干燥样本，并在通风橱中放置直至试剂完全蒸发。随后对样本进行喷金处理，用于SEM分析。

与跨牙本质扩散提取物接触的细胞反应

在牙本质处理当天，将DPSC和MDPC-23细胞接种在96孔板中（每孔1x10⁴个细胞）。平板分别用含有15%和10% FBS的α-MEM和DMEM孵育24小时。次日，将100 μL提取物应用于细胞，并在5% CO₂和37°C下孵育24小时。之后，吸出提取物并更换为新鲜培养基，每2天更换一次，总共培养7天。

对于细胞活力分析，在接触提取物后的第1、2和7天，对两种细胞应用alamarBlue方案。第1天NC的平均荧光值被视为100%细胞活力，并用于计算各时间点其他处理的细胞活力值（配对样本）。

用于细胞活力分析的相同细胞也评估了矿化结节形成。对于MDPC-23细胞，在培养7天后评估矿化，与最终的活力评估时间一致。相反，对于DPSCs，细胞在成骨培养基中额外培养7天，总共培养14天。成骨培养基（基础培养基补充100 nM地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠和50 mg/mL抗坏血酸）在成骨诱导期间每两天更换一次。之后，细胞用70%乙醇固定，并用茜素红溶液染色。将矿化结节溶解在十六烷基氯化吡啶鎓溶液（10 mM）中，在570 nm波长下测量吸光度。将值归一化为百分比，以NC为100%矿化结节沉积。在溶解结节前，用光学显微镜拍摄钙沉积的代表性图像。

抗氧化潜力

为评估黄酮类化合物的抗氧化潜力，进行了活性氧（ROS）测定。为此，将RAW 264.7鼠巨噬细胞（第8代）以5x10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中，在补充有10% FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM中于37°C和5% CO₂环境下培养24小时。随后，将细胞分为两组：一组暴露于LPS，一组不暴露。培养基（DMEM）补充0.1μg/mL LPS并与细胞孵育6小时。对于未暴露于LPS的组，更换新鲜培养基。此孵育期后，更换为跨牙本质扩散提取物，细胞再孵育24小时。之后，更换培养基为100μL含有细胞内氧化应激荧光探针的溶液，孵育10-15分钟。在490 nm激发波长和520 nm发射波长下测量荧光强度。

统计分析

自变量是牙本质处理，主要结果是接种在龋坏影响牙本质圆片上的细胞活力。总样本量（n=8个牙本质圆片/组）基于先前发表的跨牙本质细胞毒性研究，这些研究证明了在类似实验条件下检测牙本质预处理之间统计学显著差异的能力。实验在两个独立的实验场合进行（每次n=4），以确保内部有效性和可重复性。在所有分析中，牙本质圆片被视为实验单位。

使用GraphPad Prism软件（版本8.4.3）分析数据，显著性水平设为α=0.05。使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性，并使用Levene检验评估方差的同质性。根据实验设计，使用单因素或双因素方差分析（ANOVA）进行统计比较，适当时辅以Sidak多重比较检验。对于重复测量，如细胞活力测定，使用重复测量方差分析（RM-ANOVA）和Sidak事后检验分析数据。

结果

接种于龋坏影响牙本质上的MDPC-23细胞活力

接种在龋坏影响牙本质圆片髓腔面的MDPC-23细胞活力如图1所示。PC组在所有测试组中细胞活力最低，降低了97.8%（p<0.0001）。应用35%磷酸也导致与NC组相比显著降低17.1%（p=0.0060）。其他组，SC和黄酮类底涂剂，与NC和PA组无显著差异（p≥0.005）。总体而言，黄酮类底涂剂引起的细胞活力降低小于15%。

接种在牙本质圆片髓腔面的MDPC-23细胞的形态特征如图1所示。在NC组中，致密且汇合的细胞层覆盖了整个牙本质表面，没有牙本质小管暴露。观察到MDPC-23的典型形态，细胞显示大的扁平细胞质和大量负责附着于基质的表面突起。在附着于牙本质的细胞层上方可见有丝分裂细胞。相比之下，PC组显示大面积的暴露牙本质小管，只有少数附着的细胞，这些细胞表现出形态变化，如细胞质收缩、膜破裂和缺乏细胞质突起。对于NA和KA底涂剂，细胞形态与NC组相似，而BA底涂剂组的细胞则略有不同。尽管存在这些差异，细胞仍附着在牙本质上，没有牙本质小管暴露。磷酸引起了MDPC-23细胞的严重形态变化，导致因细胞脱附而暴露牙本质区域。

与提取物接触的细胞反应

两种细胞系在接触经跨牙本质扩散处理获得的提取物后不同时间点（1、3和7天）的活力和矿化反应分别如图2和图3所示。对于两种牙髓细胞系，PC组在所有三个时间点均表现出细胞活力的显著降低。对于DPSC，在第1天和第3天，所有实验组与NC相比均无显著差异（p>0.05）。然而，在第7天，用KA和NA底涂剂处理的实验组显示细胞活力比NC组显著增加（约14%）（分别为p=0.0275和p=0.0141）。相反，MDPC-23的结果揭示了细胞在不同时间点对底涂剂的 distinct 反应模式。在第1天，含有KA（p=0.0057）和NA（p<0.0001）的实验底涂剂显示细胞活力比NC降低约14%。在第3天，只有NA组降低了活力（与NC相比，p=0.0013）。然而，暴露7天后，实验组与NC之间未见显著差异（p>0.05）。

矿化结节形成的分析显示两种测试细胞类型中各实验组之间存在显著差异（图3）。在DPSCs中，NA与NC有显著差异（p=0.0223）。相反，BA和KA与NA无差异（分别为p=0.5131和p=0.6872）。然而，在MDPC-23细胞中，PC、PA和SC组显著减少了矿化结节形成，而基于黄酮类的实验底涂剂与NC组相比无显著差异（p<0.0001）。

抗氧化潜力

图4显示LPS刺激显著增加了ROS的产生（p<0.0001）。数据表示为相对于对照（无LPS培养基）的倍数增加。在没有LPS刺激的情况下，与NC相比，各测试组之间未观察到显著差异（p>0.05）。相反，在LPS刺激下，所有测试的黄酮类底涂剂均将ROS显著降低至基线水平（与其他组相比，p<0.0001），并且与无LPS刺激的条件无差异（p>0.9999）。

讨论

天然化合物，尤其是黄酮类化合物的使用，在开发用于临床应用的替代材料和技术方面已被广泛研究。这些化合物在修饰牙本质基质和提高修复体耐久性方面显示出潜力。本研究检验了牙髓细胞对实验性黄酮类底涂剂的跨牙本质反应。使用体外模型评估应用于牙本质的修复材料的生物学反应，模拟临床场景。目标是复制涉及深龋损和受影响牙本质的情况，随后按照研究组先前开发的方法，将黄酮类底涂剂应用于牙本质表面1分钟，在此条件下牙髓保持活力且未暴露。在此背景下，黄酮类底涂剂旨在作为牙本质生物改性预处理，用于保留临床可接受的剩余牙本质厚度的情况，因为通常需要约0.5毫米或更多以避免修复后牙髓损伤。考虑到深龋洞的处理由于选择性去龋原则、间接盖髓术、衬里剂和基底的生物活性以及证明无论放置何种材料长期临床成功率相似的证据而仍存争议，此处评估的底涂剂并非提议直接应用于即将露髓的区域或作为保护性衬里剂的替代品。相反，它们的作用是通过稳定牙本质基质和促进有益的生物学效应来增强龋坏影响牙本质的质量，从而在足够的剩余牙本质厚度确保牙髓活力时支持修复程序。

尽管先前的体外研究常使用0.4毫米厚的牙本质圆片，但本研究选择了0.5毫米的圆片。这一选择是因为牙本质样本是龋坏影响的，因此是脱矿的，旨在更好地模拟临床相关条件。使用微生物学龋坏诱导方案进一步强化了跨牙本质评估方法，因为它促进了与天然龋坏牙本质中所见相似的结构和生化变化。例如，由于生化改变，如更高的有机含量，特别是降解的胶原，它增加了通透性。实验底涂剂被动应用于先前用35%磷酸酸蚀的龋坏影响牙本质60秒。应用后，底涂剂未被冲洗掉；仅去除多余材料。该方案旨在模拟应用粘接树脂前的牙本质预处理。结果表明，实验性黄酮类底涂剂对成牙本质细胞没有细胞毒性作用。因此，第一个零假设，即底涂剂不会影响牙髓细胞活力，被接受。

本研究中使用的对照在先前的研究中得到验证。选择超纯水作为NC，因为它不会引起牙髓细胞毒性，而29%过氧化氢被用作PC，因其众所周知的细胞毒性作用。尽管黄酮类底涂剂未显示对成牙本质细胞的直接细胞毒性，但与NC相比，用35%磷酸处理的组观察到细胞活力降低17.1%。然而，这种降低仍低于30%，根据ISO 10993-5（2009）和ISO 7405（2018），这不被视为显著的细胞毒性效应。

磷酸对牙髓细胞的细胞毒性作用受多种因素影响，包括洞深，以及最重要的一点，与牙本质的直接和长时间接触。由于本研究中的牙本质已被龋坏脱矿，磷酸的细胞毒性效应可能被增强。此外，没有模拟牙髓内压力，这可以稀释酸并防止其到达细胞或改变培养基的pH值。为确保一致性，磷酸被应用于所有实验组（BA、KA和NA）。用黄酮类底涂剂处理的组的细胞活力与磷酸处理组相比无显著差异。然而，