综述：单细胞测序与类器官在器官发育和疾病中的应用

《Molecular Biomedicine》：Single-cell sequencing and organoids: applications in organ development and disease

本综述系统探讨了单细胞测序与类器官技术融合在生物医学研究中的变革性潜力。文章详细阐述了这两种技术如何协同揭示器官（如脑、肺、心脏、肝、肠、肾）发育的关键信号通路和细胞互作网络，并构建多种疾病（如神经退行性疾病、遗传病、传染病、肿瘤）的高保真体外模型。通过结合患者来源的类器官生物库，该技术平台加速了药物筛选和精准医疗进程，同时利用可移植组织构建开拓了再生医学新策略。文章最后展望了其与空间转录组学、基因编辑等前沿技术的深度整合，将推动生命科学实现从描述性研究到机制驱动的范式转变。

　　

单细胞测序与类器官技术的融合：解码生命发育与疾病的新范式

引言

传统生物学研究长期局限于二维（2D）细胞培养世界，这种环境缺乏天然的三维（3D）结构和复杂的细胞间通讯，难以重现活体生物活动的复杂性。类器官技术的出现彻底克服了这一局限。类器官是3D多细胞培养系统，能准确模拟人体生理状态下的复杂相互作用，是研究器官发育、疾病机制和药物筛选的理想体外平台。与此同时，单细胞测序技术能够以单细胞分辨率精确检测基因组、转录组和表观基因组，成为解析细胞异质性的核心工具。这两种技术的结合，为在高度仿真的体外模型中系统性解析疾病机制提供了强大平台。

类器官培养系统的建立与表征

自2009年成功培养出具有隐窝-绒毛结构的小肠类器官以来，类器官技术标志着生物医学研究的一项基础性突破。随后，从内胚层来源的消化和呼吸器官（如肠、肝、肺），到中胚层来源的循环和排泄系统（如肾、心、血管），再到外胚层来源的神经感觉组织（如脑、视网膜），多层类器官被相继建立。基因编辑技术（如CRISPR和碱基编辑）的引入显著增强了类器官系统的精准建模能力，能够精确引入特定基因突变以模拟疾病。工程化培养系统的创新，如多器官共培养系统和血管化类器官，进一步扩展了其应用范围。与传统的2D细胞模型和动物模型相比，类器官以其3D结构能更真实地再现体内微环境，结合单细胞测序后，可支持对细胞异质性的精确分析。

单细胞测序的演变与整合

单细胞测序的核心优势在于能够揭示传统批量测序所掩盖的细胞群体内的异质性。该技术从早期的微孔板基础方法，发展到当前强调高通量、多组学整合和空间分辨率的阶段。例如，2011年的STRT-seq引入了细胞条形码技术；SMART-seq和SMART-seq2提高了全长转录组覆盖度和灵敏度；2015年的Drop-seq整合了微流控技术，实现了数万个单细胞的同时处理，标志着自动化单细胞转录组学的开始。2017年出现的CITE-seq将单细胞测序与蛋白质表位识别相结合，能同时检测转录组和表面蛋白表达水平。空间转录组学技术进一步弥补了单细胞技术固有的空间背景信息丢失的缺陷。

类器官与单细胞测序的交汇

单细胞测序能够通过转录组分析，系统定量地评估类器官中的细胞类型组成与相应人体组织的匹配程度。例如，在脑类器官中，它可以识别关键的细胞亚型（如兴奋性神经元、抑制性神经元、星形胶质细胞）是否存在，并揭示它们与胎儿大脑发育特定阶段的对应关系。此外，单细胞测序还能精确识别由培养因子缺失或失衡引起的异常细胞状态，通过比较不同培养条件下类器官的细胞图谱，可以筛选出促进特定细胞亚型分化或功能成熟的关键因子。这种数据驱动的优化策略，结合CRISPR等技术，能够在几周内构建携带特定突变的疾病模型，显著缩短研究周期。

利用类器官和单细胞测序揭示器官发育的奥秘

单细胞测序的进展促进了器官发育的动态研究。由iPSC生成的类器官可以模拟器官发育过程。结合单细胞测序，可以分析类器官在细胞、遗传和功能水平上与真实器官的相似性，通过动态转录组谱分析理解生物体的发育分化，并阐明类器官细胞之间及其与周围基质的相互作用。

皮质

人脑是已知生物中最复杂的器官。以往的脑发育研究多依赖啮齿类动物模型，但存在物种差异限制。脑类器官逐步克服了模型构建的局限。单细胞测序在揭示类器官能高分辨率地再现人脑发育过程中的细胞类型多样性、谱系分化轨迹和基因表达特征方面发挥了关键作用。研究利用皮质类器官进行了转录组、表观基因组和空间转录组学等多层次单细胞测序，发现皮质类器官发育过程中的细胞类型多样性近似于内源性胚胎发育。在模型构建上，除了传统的基于iPSC的类器官，还出现了直接从胎儿组织培养人脑类器官的方法。为解决脑类器官缺乏功能性血管系统的问题，研究人员通过表达ETV2、共培养策略和器官融合技术，成功生成了具有复杂血管网络的脑类器官，为研究血管-神经相互作用提供了新平台。单细胞测序还扩展了脑类器官在神经退行性疾病研究中的应用，例如动态捕捉阿尔茨海默病和帕金森病相关的细胞状态变化、异常蛋白聚集和微环境扰动。

肺

作为人体重要的呼吸器官，肺具有复杂的结构和功能。肺类器官的出现极大地增进了我们对肺组织微环境及其在肺损伤后修复过程中作用的理解。研究利用人类胎儿肺泡发育的类器官模型，揭示了新生儿呼吸系统疾病的细胞命运模式和机制。气液界面（ALI）培养方法的引入显著增强了肺类器官的生理相关性。在肺发育机制研究中，结合肺类器官与单细胞测序揭示了关键调控网络。研究表明，Wnt信号通路是NKX2-1水平的关键上游调节因子。NKX2-1直接结合与肺泡分化相关基因（如SFTPC、LAMP3、SLC34A2）的启动子区域，促进其转录，从而调节肺泡细胞的分化和功能成熟。单细胞测序对新开发的肺泡类器官进行细胞组成和基因表达谱的全面分析，证实了类器官中AT2细胞的存在及其分化途径。

心脏

人类心脏是在胚胎发生过程中发育的功能性器官。心脏类器官作为研究心脏发育和疾病的关键体外模型，目前主要使用hiPSC构建。最初的心脏类器官由hiPSC衍生的心肌细胞（CMs）与原发性基质细胞、HUVECs和人心脏成纤维细胞（CFs）共同构建。随着iPSC技术的进步，当代心脏类器官主要通过将iPSC衍生的胚体直接分化为CMs或共培养iPSC来源的多种心脏细胞类型形成。生理上，人类心脏类器官基本模拟了体内细胞的分布、对外部刺激的反应和电生理功能。为了模拟患者特异性遗传变异，研究人员使用hiPSC衍生的CMs、CFs和ECs构建心脏类器官，并可通过基因编辑技术引入可控的遗传突变。有研究通过精确补充促进造血和血管发育的多种因子（如BMP4、bFGF、VEGF），建立了生血心形成类器官，成功创建了具有核心、心肌层和外层的三层结构。在该模型中，血管生成过程涉及VEGF信号通路和经典的Angiopoietin/TIE2信号通路。单细胞测序用于检查生血心形成类器官的基因表达谱，准确识别了心肌细胞、各种EC类型、造血祖细胞、红细胞前体和白细胞前体。此外，还成功培育了包含右心室、左心室、心房、流出道和房室管的多腔室心脏类器官，其基因表达谱对应于体内发育的不同腔室。

肝脏

肝脏是负责氨基酸和维生素产生与储存以及代谢和解毒等多种功能的重要器官。传统的肝细胞单培养不能长期保持稳定。多细胞肝组织培养比肝细胞单培养更适合药物筛选、疾病建模和移植治疗。2013年，研究人员通过向培养系统中添加HGF、EGF和FGF等成分，成功建立了小鼠来源的肝脏类器官系统。2019年，一项新开发的方法利用完全确定的无血清和无饲养层培养基，生产出hESC衍生的可扩展肝脏类器官。这些类器官稳定保持了肝干/祖细胞的双潜能表型，使其能够分化为功能性肝细胞或胆管细胞。肝脏类器官成功再现了肝小叶的区域化现象，这是肝代谢功能的关键特征。单细胞测序揭示了Wnt/CTNNB1（β-catenin）信号梯度在建立区域化中的核心调控作用。分析类器官内肝细胞基因表达的空间分布，揭示了具有不同代谢功能的肝细胞亚群表现出与体内相似的分布模式。肝脏类器官在高通量功能基因组学研究中也显示出巨大潜力，被用于进行大规模CRISPR筛选，系统识别肝脏发育和疾病中涉及的关键基因网络。HGF通过与其跨膜受体c-Met结合启动信号转导，激活PI3K/AKT信号通路，促进细胞周期进程，从而促进肝类器官细胞的增殖。研究人员还采用共培养技术建立了成年小鼠肝胆类器官的培养模型，并追踪了hiPSC来源的成人肝细胞类器官的培养，首次观察到成人肝细胞类器官培养中增殖启动的缺乏和脂质代谢的抑制。单细胞测序精确识别了肝脏发育和成熟过程至关重要的调控基因。

肠道

肠道发育是一个高度复杂的过程，肠道类器官在该领域扮演着关键角色。先进单细胞测序技术被用于详细研究肠道上皮细胞的分化轨迹。2009年，报道了将小鼠LGR5+肠道干细胞在体外培养成小鼠小肠类器官，重现了隐窝和绒毛样上皮区域的3D结构。随后的培养条件优化使得能够准确模拟小鼠小肠上皮的生理状态。研究还证明了利用hPSC在体外模拟胚胎肠道发育。分离的肠道干细胞在体外培养成肠道类器官依赖于重现肠道干细胞增殖、分化和迁移所需的微环境。单细胞转录组图谱被用于阐明细胞状态，并对人类肠道类器官进行基准测试，证明了间充质干细胞（MSCs）对肠道发育的影响。研究证明激活BMP信号通路可产生具有早期造血特征的结肠类器官。BMP信号通路被发现可快速激活，有效引导hPSC向肠道类器官分化。BMP2处理显著增加了p-SMAD1/5/8的水平，这是BMP信号通路中的关键步骤。BMP2诱导SATB2的表达，并促进后部HOX基因的表达，从而在肠道管模式化中发挥关键作用。经BMP2处理的类器官表现出与远端肠道一致的标志物表达模式。当移植到体内时，人类肠道类器官和结肠类器官保留了其区域特征。此外，经BMP2处理的结肠类器官可以产生结肠特异性内分泌细胞，进一步阐明了BMP信号通路的关键作用。肠道上皮中存在各种罕见细胞类型，尽管比例极低，但在生理和病理过程中起着至关重要的作用。肠道类器官和单细胞测序技术的结合为这些细胞的研究提供了突破性工具。其中，对肠内分泌细胞（EECs）的研究最具代表性。单细胞测序技术通过对人类肠道发育的系统分析，揭示了EGF/ERBB等信号通路的复杂性，并识别了罕见细胞类型分化所涉及的关键因子。人类EEC组织的单细胞转录组图谱的构建显著推进了对罕见肠道细胞的深入研究。CRISPR/Cas9等基因组编辑技术的发展使肠道类器官从发育模型转变为功能研究平台。研究通过