新型环状七肽作为潜在的治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的药物

《Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology》：Novel cyclic heptapeptides as potential therapeutics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections

本研究设计并合成了100种新型环七肽，通过计算模拟和实验验证发现Ala?、Gly?、Tyr?对MRSA具有显著抗菌活性，其中Ala?的MIC值与莫西沙星相当，且生物相容性优异，表现出良好的开发潜力。

　　
近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的全球流行形势日益严峻。MRSA不仅对多种β-内酰胺类抗生素产生耐药性，还通过产酶、主动外排泵和靶点修饰等机制规避抗菌药物攻击，导致其感染死亡率高达20%以上（Hasanpour等，2023）。尽管已有vancomycin、daptomycin等治疗药物，但耐药菌株的持续进化仍对现有疗法构成挑战。为此，研究者聚焦于开发新型环状七肽类药物，这类结构兼具稳定性和靶向性优势，在天然产物如teixobactin（Hussein等，2020）和合成生物学领域均展现出潜力。

研究团队通过计算生物学与实验验证相结合的创新策略，成功筛选出Ala?、Gly?和Tyr?三种候选化合物。其设计过程基于5BS3蛋白复合物的晶体结构（PDB:5BS3），该蛋白编码的DNA回旋酶是MRSA耐药的核心靶点。通过 CASTp pocket analysis，研究者发现该蛋白结合口袋具有典型“口袋-通道”结构：入口区域（6-8 ?）形成狭窄通道，向内扩展为富含极性残基的酸性区（Asp192、Glu218）和疏水性口袋（Leu216、Phe220等）。这种拓扑特征为设计具有不同疏水-极性平衡的环状肽提供了理论依据。

在分子模拟阶段，结合AutoDock Vina与Pearl程序的多轮虚拟筛选，最终确定三个候选分子。值得注意的是，所有筛选化合物均通过虚拟 ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）评估，其LogS值（溶解度）分布在-3.17至-2.94之间，符合临床候选物的理化标准。特别的是，Ala?在P-glycoprotein抑制活性（Pgp-inh=0.001）和蛋白结合率（PPB=11.09%）方面表现优异，提示其可能通过主动转运机制实现高效递送。

合成工艺采用固相多肽合成（SPPS）技术，通过Rink酰胺树脂载体实现了高纯度（94%以上）产物的规模化制备。该工艺创新性地引入硫醇-二硫键闭环反应，不仅解决了传统合成中闭环效率低的问题，还通过引入二硫键（S-S键长2.05±0.05 ?）增强了分子的刚性，使七肽环结构稳定在20原子的大环体系（分子量约800-900 Da），这为后续的结构生物学研究提供了分子基础。

抗菌活性测试显示，Ala?展现出类氟喹诺酮类药物的广谱活性。其MIC值（抑菌浓度）在22.1-39.5 μg/mL范围内，与标准药moxifloxacin（22.3-27.5 μg/mL）接近，但显著优于Gly?（39.9-56.8 μg/mL）和Tyr?（67.1-73.9 μg/mL）。值得注意的是，Ala?在4×MIC浓度下对MSSA（敏感金黄色葡萄球菌）的CFU（菌落形成单位）抑制率可达89.9%，且在24小时培养周期内保持稳定杀菌效果。这种快速杀灭特性（5小时内达峰值抑制）可能与其靶向DNA回旋酶的不可逆结合有关，通过分子动力学模拟（100 ns）证实，Ala?与蛋白复合物的RMSD（均方根偏差）始终低于1.5 ?，表明其结合具有高度稳定性。

生物相容性测试进一步凸显Ala?的临床潜力。在100 μg/mL浓度下，其溶血活性仅为3.23%，而传统抗生素moxifloxacin在此浓度下仍产生0.94%溶血。这种差异源于Ala?的疏水核心（含Ala、Trp等疏水氨基酸）与亲水头部（含Arg、Asp等极性残基）的完美平衡，通过电子顺磁共振（ESR）和圆二色光谱（CD）证实其氨基酸残基的二级结构在溶液中保持高度一致性（β-折叠占比>70%）。

DFT计算揭示了Ala?的电子特性优势。在B3LYP/6-31g(d,p)水平优化后，其HOMO-LUMO能隙（4.79 eV）显著低于同类分子，表明其具有更强的电子跃迁能力。特别值得注意的是，Ala?的LUMO轨道与蛋白关键残基（Asp1083、Ser1084）的π*轨道存在重叠，这种电子互补性可能解释其高达-11.23 kcal/mol的结合能。此外，分子动力学模拟显示，Ala?与5BS3复合物的盐桥接触数（155个）远超moxifloxacin（167个），但关键氢键网络（如Asp1083-N…O）的稳定性提升达23%，这与其在时间-kill实验中展现的快速杀菌效果相吻合。

临床前研究还发现Ala?的独特代谢稳定性。通过LC-MS/MS监测显示，在72小时体外稳定性实验中，其主代谢产物仍保持≥85%原始浓度，这归功于环状结构对酶解位点的屏蔽效应。体外毒性实验表明，Ala?在50 μg/mL浓度下仍保持<5%溶血率，而Gly?在此浓度下溶血率已达9.3%，这可能与Gly?分子中存在刚性环状结构导致空间位阻增加有关。

该研究突破性地将计算化学的虚拟筛选效率提升至传统方法的3倍以上（通过Pearl程序加速），结合固相合成技术实现100种候选分子的规模化制备。特别设计的硫醇-二硫键闭环工艺（成功率≥94%）解决了环状肽合成中的关键难题，为后续开发高纯度（≥95%）制剂奠定了基础。当前研究已建立完整的药物开发管线：计算筛选（100种候选）→固相合成（3种优选）→体外药效验证→结构生物学解析→DFT优化→临床前毒理学测试。

未来研究可聚焦于：（1）通过表面等离子共振（SPR）技术建立Ala?与5BS3的构象特异性结合模型；（2）开发基于酶解标记的代谢追踪技术，解析Ala?在体内药代动力学特征；（3）利用冷冻电镜（Cryo-EM）技术解析Ala?与5BS3复合物的三维结构，为后续开发小分子类似物提供靶点信息；（4）构建基于人工智能的分子生成器，预测具有更好ADMET特性的衍生物。这些研究方向的推进，有望使新型环状肽类药物在5-7年内进入临床候选阶段，为全球MRSA防控提供创新解决方案。