p53剂量依赖性激活调控内皮细胞命运：血管生成新机制与治疗潜力

《Cell Death & Disease》：Pharmacological activation of p53 induces dose-dependent changes in endothelial cell fate during angiogenic sprouting

本研究针对p53在血管生成过程中调控内皮细胞命运的剂量效应机制不明确的问题，通过药理学激活p53，首次揭示了低浓度p53诱导可逆细胞周期阻滞，而高浓度引发衰老/凋亡的梯度效应。研究发现所有浓度p53激活均抑制静脉血管生长，并通过改变尖端/柄状细胞特异性基因表达影响细胞命运，为靶向病理性血管生成提供了新策略。

　　

在生命体复杂的血管网络构建过程中，内皮细胞通过精确分化为尖端细胞（tip cell）和柄状细胞（stalk cell）来驱动血管生成（angiogenesis）。这一过程在胚胎发育和组织修复中至关重要，但其失调也会导致癌症、年龄相关性黄斑变性等疾病中异常血管的生长。细胞周期调控被认为是决定内皮细胞命运的关键因素，而著名的肿瘤抑制蛋白p53作为细胞周期的核心调控者，其在生理性血管生成中的作用却充满矛盾。既往研究显示，p53在内皮细胞中的激活既能促进血管出芽，也能抑制血管生长，这种看似矛盾的现象背后，是否隐藏着p53激活水平决定其功能的“剂量效应”奥秘？为了解开这个谜题，由Omayma Al-Radi、Katrine Ingelshed和Lisa Eichhorn等共同完成，发表在《Cell Death & Disease》上的研究，首次系统揭示了p53水平如何梯度调控内皮细胞命运，并意外地发现所有测试水平的p53激活均能抑制血管生长。

为开展本研究，研究人员主要运用了几项关键技术：利用MDM2小分子抑制剂（navtemadlin, nutlin-3a）和钉合肽（stapled peptide）抑制剂（sulanemadlin）进行p53的药理学激活；通过蛋白质组学（质谱分析）全面分析p53激活后的分子变化；采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）的体外三维血管生成模型（内皮细胞球体出芽实验）；利用转基因斑马鱼胚胎模型（Tg(fli1:eGFP)）进行体内血管生成评估；并通过流式细胞术结合CD34标记区分尖端样和柄状样细胞群体，分析其p53活性和细胞周期分布。

Graded p53 activation by MDM2 inhibitors induces distinct cell fates in endothelial cells

研究人员首先使用不同浓度的MDM2抑制剂（navtemadlin, nutlin-3a）和MDM2/MDMX钉合肽抑制剂（sulanemadlin）处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC），发现它们均能浓度依赖性地抑制细胞生长，其中navtemadlin效力最强（IC₅₀=0.010μM）。恢复实验表明，低浓度（0.01μM）navtemadlin处理24小时后细胞生长可恢复，而高浓度（0.5μM）则导致不可逆的生长抑制。形态学观察显示，高浓度navtemadlin处理72小时后，内皮细胞出现圆缩，提示细胞死亡。在分子水平上，Western blot和免疫荧光染色证实，低浓度（0.05μM）navtemadlin主要上调p53、MDM2和p21（细胞周期阻滞标志物）表达，而高浓度（1μM）则显著诱导PUMA（p53上调凋亡调控因子）表达、细胞死亡（Sytox Green染色阳性）和衰老（β-半乳糖苷酶染色阳性）。这些结果表明，p53的药理学激活在内皮细胞中诱导了浓度依赖性的细胞命运转变：低浓度引起细胞周期阻滞，高浓度引发细胞死亡和衰老。

The cellular effects induced by navtemadlin are largely p53-dependent

为了确认navtemadlin的效应是p53依赖性的，研究人员利用Dicer-substrate siRNA (DsiRNA)敲低HUVEC中的TP53基因。结果显示，在TP53敲低细胞中，navtemadlin（1μM）诱导的TP53、CDKN1A（编码p21）和MDM2的mRNA水平升高被显著抑制。在蛋白水平上，TP53敲低也部分挽救了navtemadlin诱导的p53、p21和PUMA蛋白表达上调，并减轻了细胞圆缩的形态学变化。这些证据强有力地表明，navtemadlin引发的主要分子和表型效应是通过p53介导的。

Different protein networks are affected by increasing levels of p53 activation in HUVEC

为了更全面地了解p53激活引起的分子变化，研究人员对经DMSO、0.05μM或1μM navtemadlin处理24小时的HUVEC进行了蛋白质组学分析。质谱分析检测到2800种蛋白质，其中0.05μM处理组有87种、1μM处理组有632种蛋白质的丰度发生差异性变化。低浓度navtemadlin主要下调与DNA复制（如MCM2）和细胞周期（如CDK1）相关的蛋白质。高浓度处理则导致更多蛋白质变化，包括下调与血管生成相关的血小板反应蛋白1（THBS1）和血小板内皮细胞粘附分子（PECAM），上调与氧化应激反应相关的p53诱导蛋白3（TP53I3）。功能富集分析显示，低浓度p53激活影响的蛋白质网络富集于DNA复制和细胞周期等生物学过程，而高浓度激活则显著影响胞质翻译和核糖体生物合成等通路。这些蛋白质组学数据从系统层面证实了p53激活的浓度依赖性效应。

All levels of p53 activation reduce vessel growth and integrity in vitro and in vivo

尽管低浓度和高浓度p53激活诱导了不同的细胞命运，但令人意外的是，在体外三维HUVEC球体出芽实验中，所有测试浓度的navtemadlin均显著抑制了血管内皮生长因子（VEGF）诱导的血管出芽，表现为出芽总长度、与球体相连的芽孢比例以及出芽总数均减少。在TP53敲低的HUVEC球体中，navtemadlin未能进一步抑制出芽，证实该效应是p53依赖性的。虽然出芽被抑制，但细胞迁移（划痕实验）在10小时内未受显著影响。进一步的研究发现，navtemadlin处理降低了内皮细胞单层中紧密连接蛋白（ZO-1）和粘附连接蛋白（VE-cadherin）的表达，并增加了单层对荧光葡聚糖的通透性，表明血管完整性受损。在斑马鱼胚胎模型中，使用sulanemadlin处理同样显著抑制了肠下静脉丛（SIV）的血管生长，并导致异常尖端突起滞留。这些体内外结果一致表明，不同水平的p53激活均能抑制静脉血管的生长和完整性。

Increasing levels of p53 activation induce different effects in tip-like and non-tip-like cells

为了探究血管生长抑制的细胞机制，研究人员分析了p53激活对尖端样和柄状样细胞的影响。在HUVEC球体中，高浓度navtemadlin（1μM）显著减少了VEGF诱导的尖端细胞和柄状细胞数量。流式细胞术分析显示，高浓度navtemadlin降低了CD34阳性（尖端样）细胞的比例。在分子机制上，navtemadlin处理增加了CD34阳性和CD34阴性（非尖端样）细胞中的p53水平，但p21（p53转录活性标志）的显著增加仅见于CD34阴性细胞。细胞周期分析揭示，低浓度navtemadlin主要减少CD34阴性细胞的增殖并增加G₀/G₁期阻滞，而高浓度则同时影响CD34阳性和阴性细胞，减少增殖并增加G₂/M期阻滞。基因表达分析发现，高浓度navtemadlin处理在有无VEGF条件下均降低了多数尖端细胞标志基因（如ANGPT2, CXCR4）的表达。这些结果说明，p53激活以浓度依赖的方式差异性地影响尖端样和非尖端样细胞：低浓度主要抑制柄状样细胞的增殖，而高浓度则同时损害两种细胞的细胞周期调控和血管生成相关基因表达。

综上所述，本研究首次系统地阐明了p53激活水平在内皮细胞命运决定和血管生成中的梯度效应。低水平p53激活引发可逆的细胞周期阻滞，主要影响增殖活跃的非尖端样细胞；而高水平p53激活则诱导细胞死亡和衰老，并改变尖端样和非尖端样细胞的基因表达谱。尽管细胞水平的效应不同，但所有测试水平的p53激活均一致地抑制了静脉血管的生长。这一发现统一了此前关于p53在内皮细胞中作用看似矛盾的报告，并揭示了p53的“剂量”是其功能决定因素。该研究的深刻意义在于，它不仅深化了对p53这一经典肿瘤抑制因子在血管生物学中作用的理解，更重要的是为治疗病理性血管生成疾病（如癌症、视网膜病变）提供了新的思路：即通过精确调控p53的激活水平，可能实现对异常血管的靶向干预，同时最大限度地减少对正常组织的损伤。未来的研究可以在此基础上，进一步探索如何在疾病模型中实现这种精准的p53调控，从而将这一基础生物学发现转化为潜在的治疗策略。