《Journal of Controlled Release》：mRNA based in vivo MG1113 antibody production as a potential therapeutic approach for hemophilia
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mRNA-LNP递送长效抗TFPI抗体治疗血友病新策略，通过优化mRNA序列和靶向肝脏递送实现持续抗体表达和抑制凝血因子级联反应，克服传统蛋白疗法的稳定性与重复给药问题。
米英（Miyoung Oh）、玉贞（Yujeong Jeong）、贤贞（Hyein Jung）、永珠（Yongjoo Byeon）、惠春（Heechun Kwak）、宋燮（Songseop Kim）、元孝（Wonhyo Seo）、在成（Jaesung Jung）、赫珍（Hyukjin Lee）
韩国首尔03760，梨花女子大学药学院及药学研究生院
摘要
血友病是一种遗传性出血性疾病，由凝血因子VIII或IX的缺乏引起。尽管目前的治疗方法（包括因子替代疗法、双特异性抗体和基因疗法）已经改善了疾病的管理，但这些方法仍受到半衰期短、免疫原性、制造过程复杂以及需要反复给药的限制。本文报道了一种利用脂质纳米颗粒（LNP）包裹的信使RNA（mRNA）来传递MG1113的方法。MG1113是一种人源化单克隆抗体，可靶向组织因子通路抑制剂（TFPI），从而实现体内持续产生抗体，作为一种与因子无关的治疗策略。通过定制信号肽、调控性非翻译区（UTR）、尿苷缺失和N1-甲基伪尿苷的引入，优化了mRNA的翻译效率和稳定性。将MG1113 mRNA-LNPs系统性给药给小鼠和兔子后，与直接给药重组MG1113蛋白相比，获得了更强且持久的抗体表达、有效的血浆TFPI抑制作用以及更长的药效持续时间。本研究探索了mRNA-LNP平台在血友病中的抗体递送应用，具有延长药理活性、简化制造过程和灵活治疗应用的潜力。
引言
血友病是一种罕见的遗传性出血性疾病，由凝血因子VIII（血友病A）或因子IX（血友病B）的缺乏引起，导致凝血酶生成受损，从而增加自发性及持续性出血的风险[1]。传统上，通过静脉输注缺失的凝血因子来治疗该病，这可以有效预防或控制出血。然而，这种方法存在半衰期短、需要频繁给药以及可能产生中和抗体从而降低治疗效果等局限性[2][3][4]。这些挑战不仅降低了患者的依从性，还显著影响了生活质量。
最近在非因子相关疗法方面的进展（如双特异性抗体）使得皮下给药成为可能，并提高了具有抑制性抗体的患者的疗效[5][6]。但这些疗法存在免疫介导的不良反应和血栓形成的风险，同时其生产过程非常复杂，也需要持续给药。基因疗法也有望长期纠正凝血因子缺乏问题，但面临诸多障碍，包括宿主对病毒载体的免疫反应、疗效不确定性、肝毒性以及高昂的成本[7][8]。综上所述，亟需开发出具有持久疗效、较低免疫原性和更好患者便利性的替代策略[4][9][10][11]。
在新兴的替代方案中，内源性抗凝途径的治疗调节显示出巨大潜力。组织因子通路抑制剂（TFPI）是外源性凝血级联反应的关键调节因子，通过抑制TF/FVIIa/FXa复合物和凝血酶原酶活性发挥作用[12]。无论是否存在因子抑制剂，抑制TFPI都能恢复凝血酶生成，改善血友病A和B的止血效果。几种抗TFPI抗体（如marstacimab和concizumab）已获得监管批准，证实TFPI是一个具有临床应用价值的靶点[13][14]。然而，传统的基于蛋白质的抗体递送方法仍受生产瓶颈、稳定性问题和需要反复给药的限制[15][16][17][18][19][20]。体内可翻译mRNA技术的出现为抗体递送提供了新的途径。合成mRNA封装在脂质纳米颗粒（mRNA-LNPs）中，能够在体内直接、可控且可扩展地生产治疗性蛋白质，规避了重组蛋白疗法的许多局限性[21][22][23][24][25]。这种方法结合了抗体靶向的高特异性和mRNA递送平台的药代动力学及制造优势。
MG1113是一种完全人源化的单克隆抗体，可靶向TFPI用于血友病A和B的预防性治疗[26][27]。尽管其重组形式在临床前和早期临床研究中显示出疗效，但其生产和给药仍受到传统生物制剂递送方法的限制。本文报道了一种优化后的mRNA-LNP系统的开发及其在体内的验证，作为下一代非因子相关血友病疗法。为了最大化表达和治疗效果，对MG1113 mRNA进行了信号肽和密码子使用的优化，以及调控性UTR和核苷修饰（包括尿苷缺失和N1-甲基伪尿苷的引入）。使用靶向肝脏的LNPs进行系统性给药，实现了体内强烈的抗体产生。在小鼠和兔子模型中的药代动力学和药效研究表明，与直接给药重组蛋白相比，MG1113的表达更为持久，TFPI抑制效果更显著，治疗作用也更长久。
本文探讨了一种mRNA-LNP平台，可实现体内持续表达MG1113，为血友病提供可扩展的治疗方案，有望克服重组抗体的局限性，并加速出血性疾病疗法的研发。
体外检测mRNA编码的MG1113 IgG4表达的构建
如图1A所示，编码HC和LC的mRNA分子包含5′帽结构、5′和3′非翻译区（UTR）、蛋白质编码序列区域以及约120个核苷酸（nt）的多聚(A)尾。本研究中使用的mRNA采用了Cap1结构，并分别选择人和小鼠的α珠蛋白序列作为5′和3′ UTR。这些序列已被证明能促进高效表达[28]。在此基础上，我们进一步优化了RNA构建...
血友病是一种遗传性出血性疾病，由凝血因子VIII（血友病A）或IX（血友病B）的缺乏或功能障碍引起，最常见的原因是X连锁基因突变。虽然重组或血浆来源的凝血因子的预防性给药显著改善了临床结果，但这种方法仍需频繁静脉给药，治疗负担重，并且可能出现中和抗体，从而降低治疗效果[2][3][4]。
最近在非因子相关疗法方面的进展（如双特异性抗体）使得皮下给药成为可能，提高了具有抑制性抗体的患者的疗效[5][6]。然而，这些疗法存在免疫介导的不良反应和血栓形成的风险，同时生产过程复杂，也需要持续给药。基因疗法也有望长期纠正凝血因子缺乏问题，但面临诸多挑战，包括宿主对病毒载体的免疫反应、疗效不确定性、肝毒性和高成本[7][8]。因此，亟需开发出具有持久疗效、较低免疫原性和更好患者便利性的替代策略[4][9][10][11]。
在治疗调节内源性抗凝途径方面也取得了显著进展。组织因子通路抑制剂（TFPI）是外源性凝血级联反应的关键调节因子，通过抑制TF/FVIIa/FXa复合物和凝血酶原酶活性发挥作用[12]。无论是否存在因子抑制剂，抑制TFPI都能恢复凝血酶生成，改善血友病A和B的止血效果。几种抗TFPI抗体（如marstacimab和concizumab）已获得监管批准，证实TFPI是一个具有临床应用价值的靶点[13][14]。然而，传统的基于蛋白质的抗体递送方法仍受生产瓶颈、稳定性问题和需要反复给药的限制[15][16][17][18][19][20]。体内可翻译mRNA技术的出现为抗体递送提供了新的途径。合成mRNA封装在脂质纳米颗粒（mRNA-LNPs）中，能够在体内直接、可控且可扩展地生产治疗性蛋白质，规避了重组蛋白疗法的许多局限性[21][22][23][24][25]。这种方法结合了抗体靶向的高特异性和mRNA递送平台的药代动力学及制造优势。
MG1113是一种完全人源化的单克隆抗体，可靶向TFPI用于血友病A和B的预防性治疗[26][27]。尽管其重组形式在临床前和早期临床研究中显示出疗效，但其生产和给药仍受到传统生物制剂递送方法的限制。本文报道了一种优化后的mRNA-LNP系统的开发及其在体内的验证，作为下一代非因子相关血友病疗法。为了最大化表达和治疗效果，对MG1113 mRNA进行了信号肽和密码子使用的优化，以及调控性UTR和核苷修饰（包括尿苷缺失和N1-甲基伪尿苷的引入）。使用靶向肝脏的LNPs进行系统性给药，实现了体内强烈的抗体产生。在小鼠和兔子模型中的药代动力学和药效研究表明，与直接给药重组蛋白相比，MG1113的表达更为持久，TFPI抑制效果更显著，治疗作用也更长久。
体外检测mRNA编码的MG1113 IgG4表达的构建
如图1A所示，编码HC和LC的mRNA分子包含5′帽结构、5′和3′非翻译区（UTR）、蛋白质编码序列区域以及多聚(A)尾（约120个核苷酸）。本研究中使用的mRNA采用了Cap1结构，并分别选择了人和小鼠的α珠蛋白序列作为5′和3′ UTR。这些序列已被证明能促进高效表达[28]。在此基础上，我们继续优化了RNA构建...
