《Journal of Controlled Release》：A single extracellular vesicle-based platform supporting both RBD protein and mRNA vaccination against SARS-CoV-2
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本研究开发了一种模块化外泌体疫苗平台，利用声波冲击外泌体工程技术（SWEET）高效封装SARS-CoV-2受体结合域（RBD）蛋白和mRNA抗原至LPS激活的THP-1单细胞来源外泌体（aTEVs），无需佐剂即可在小鼠中诱导出强效的体液和细胞免疫应答，冻干后仍保持免疫原性，为新型疫苗提供可扩展解决方案。
Jihwa Chung | Kyoung Hwa Kim | Shung Hyun An | DaeHo Bae | Hyo Kyeong Kim | Yujeong Choi | Jae Hwan Kim | Kihwan Kwon | Seok-Hyun Kim
Exollence Co., Ltd., 首尔 07985, 韩国
摘要
COVID-19大流行凸显了安全、有效且灵活的疫苗平台的迫切需求。本文介绍了一种基于模块化细胞外囊泡（EV）的疫苗系统，该系统采用冲击波细胞外囊泡工程技术（SWEET）进行构建——这是一种基于声学冲击波的后加载方法，能够高效地将蛋白质或mRNA抗原封装到免疫刺激型EV中。以SARS-CoV-2受体结合域（RBD）作为模型抗原，我们实现了RBD蛋白（相对于初始输入量约为69%）和RBD mRNA（相对于总EV相关mRNA的Benzonase保护部分约为75%）的高效封装，且不会影响囊泡的完整性。无论是蛋白质还是mRNA负载的EV疫苗，都能在小鼠体内引发强烈的体液免疫反应和平衡的Th1/Th2细胞免疫反应，其中和抗体滴度和细胞因子谱与铝佐剂对照组相当或更优。值得注意的是，冻干后的EV疫苗在4°C下保存7天后仍保持免疫原性，支持无需冷链运输的配送。据我们所知，这是首次证明单一后加载EV平台可以独立递送功能性蛋白质或mRNA疫苗，并实现可量化的细胞内表达和强烈的免疫激活。SWEET平台的可扩展性、模块化以及与临床常用组分的兼容性，使其成为一种有前景的下一代疫苗和药物递送技术。
引言
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行已影响全球数亿人，并导致数百万人死亡。这场危机凸显了安全、有效且能快速适应新病原体的新型疫苗平台的迫切需求。在各种方法中，基于mRNA的疫苗表现出显著的有效性和可扩展性[1,2]，而基于纳米载体的系统（如脂质纳米颗粒和微粒）也显示出临床潜力[3]。然而，当前的纳米载体平台仍存在局限性，包括潜在的免疫原性、不同的佐剂反应以及长期安全性和耐久性方面的担忧[4,5]。
作为替代方案，细胞外囊泡（EV）作为一种天然的、生物相容的载体，具有内在的免疫调节特性[6,7]。几乎所有类型的细胞都会分泌EV，其大小从20到4000纳米不等，可携带多种蛋白质、脂质和核酸[8]。它们与免疫细胞的天然结合能力使其成为疫苗递送的理想候选者。特别是来自间充质干细胞（MSCs）或免疫细胞（如M1巨噬细胞和活化的THP-1细胞）的EV在多种临床前模型中显示出免疫刺激功能，包括涉及SARS-CoV-2和癌症的模型[6,9,10]。基于外泌体的疫苗自21世纪初就开始研究，并已被证明能引发抗原特异性的细胞毒性T细胞反应[[11], [12], [13]]。
尽管EV作为递送载体具有巨大潜力，但传统的货物加载方法（包括被动孵育、电穿孔和超声处理）通常存在封装效率低、重复性差以及囊泡损伤严重的问题，这可能影响递送效果和安全性[[14], [15], [16], [17], [18]]。因此，迫切需要更安全、更稳健的EV工程方法。
冲击波（SW）技术是一种高能声学脉冲，此前用于碎石术和肌肉骨骼治疗[19,20]，最近被探索用于提高膜通透性并促进分子进入生物系统[[21], [22], [23]]。在我们之前的研究中，我们证明了低能量SW可以通过一种新的物理机制直接将siRNA转染到哺乳动物细胞中[24]。基于这一原理，我们随后开发了一种可扩展且高效的EV工程方法，称为SWEET（冲击波细胞外囊泡工程技术）。SWEET利用声学冲击波实现高效、非破坏性的后加载，将多种生物货物（包括siRNA和mRNA等核酸以及蛋白质）高效地加载到EV中，而不会影响囊泡的完整性。在最近的一项研究中，我们报告称基于SWEET的siRNA负载EV在体内有效抑制了KRAS突变肿瘤的生长，凸显了该平台的转化潜力[25]。
在本研究中，我们应用SWEET将SARS-CoV-2受体结合域（RBD）蛋白和编码RBD的mRNA封装到来自LPS激活的THP-1细胞（aTEVs）的免疫刺激型EV中。我们证明，aTEV-RBD-Pro和aTEV-RBD-mRNA均能在小鼠体内引发强烈的RBD特异性体液和细胞免疫反应，且无需额外佐剂。此外，冻干后的aTEV疫苗仍保持其免疫原性，支持无需冷链运输的配送。这些发现表明，单一工程化的EV平台可以独立支持蛋白质和mRNA疫苗的递送，为未来的疫苗开发提供了一种灵活、可扩展且具有临床意义的方法。
章节片段
细胞培养
THP-1人单核细胞从韩国细胞系库（首尔）获得，并在添加了10%胎牛血清（FBS；Biowest）和1%青霉素/链霉素（Corning）的RPMI 1640培养基中培养。JAWSII小鼠树突状细胞从ATCC获得，并在添加了20% FBS、5 ng/mL重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF；BioLegend）和1%青霉素/链霉素的Alpha Minimal Essential Medium（MEM-α；Welgene）中维持。
来自LPS激活的THP-1细胞的EV的免疫刺激效应
< />讨论
在本研究中，我们利用活化单核细胞衍生的EV的免疫刺激特性，并结合冲击波（SW）介导的后加载技术，开发了一种模块化的基于细胞外囊泡（EV）的疫苗平台。来自脂多糖（LPS）激活的THP-1单核细胞的EV具有天然的佐剂样活性，用于递送SARS-CoV-2受体结合域（RBD）蛋白和编码RBD的mRNA。值得注意的是，这两种货物形式均引发了强烈的抗原特异性免疫反应
结论
本研究介绍了一种多功能的基于EV的疫苗平台，结合了先天免疫刺激、后加载灵活性以及高效率的蛋白质和mRNA抗原递送能力。与以往依赖内源性货物表达的EV疫苗策略不同，我们的SWEET平台能够实现剂量定义的、可量化的、功能验证的抗原递送。据我们所知，这是首次证明单一工程化的EV系统可以独立递送蛋白质和mRNA
机构审查委员会
本研究遵循《赫尔辛基宣言》的指导原则，并获得了Ewha Womans大学动物实验伦理委员会的批准（协议代码EUMC-IACUC-22-006，批准日期：2022年5月31日）。
CRediT作者贡献声明
Jihwa Chung：撰写——原始草稿，研究。
Kyoung Hwa Kim：撰写——原始草稿，研究。
Shung Hyun An：撰写——原始草稿，研究。
DaeHo Bae：研究。
Hyo Kyeong Kim：研究。
Yujeong Choi：研究。
Jae Hwan Kim：研究。
Kihwan Kwon：撰写——审稿与编辑，研究，资金获取，概念化。
Seok-Hyun Kim：撰写——审稿与编辑，监督，概念化。
资助
本研究得到了韩国健康技术研发项目（通过韩国健康产业发展研究所KHIDI）的资助，该项目由韩国卫生福利部（No. HV22C0030）支持；同时得到了韩国中小企业技术信息促进机构（TIPA）（No. S3313778）和韩国国家研究基金会（NRF，由教育部资助，项目编号：2023M3A9G106060112）的支持；此外还得到了中小企业和初创企业技术发展计划及信息通信技术的支持。
