《Journal of Controlled Release》：Tumor-specific glyco-detonators: A neuraminidase-3-gated programmable DNA Nanoarchitectonics for liver cancer-exclusive chemotherapy
编辑推荐：
DNA纳米计算机通过神经氨酸酶3（NEU3）和肝细胞糖蛋白受体（ASGPR）双重锁定机制实现肝癌靶向治疗，抑制肿瘤生长82%并减少肝毒性。
雷莉|胡静|杨文|李静英
新基石科学实验室，中国教育部食品安全与生物分析科学重点实验室，福州大学化学学院，福州350108，中国
摘要
肝细胞癌（HCC）在早期阶段的无声进展以及缺乏可靠的生物标志物，常常导致晚期诊断。此时，传统的化疗方法具有高毒性且疗效有限。为了弥合这一诊断与治疗之间的差距，我们设计了一种DNA纳米计算机，它作为生物逻辑门，将病理标志物转化为治疗指令。这种“双锁”系统利用唾液酸“帽”来掩盖DNA支架上的半乳糖配体。肿瘤过表达的神经氨酸酶3（NEU3）首先切割这些“帽”，暴露出半乳糖，从而触发无唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）介导的内吞作用，完成HCC特异性的激活级联反应。在原位HCC模型中，该系统抑制了82%的肿瘤生长，并消除了游离多柔比星的非靶点肝毒性。其特异性通过HCC细胞与正常肝细胞之间的差异细胞毒性以及空间限定的肿瘤凋亡得到了验证。通过将治疗反应编程到肿瘤特异性酶电路中，这项工作为代谢引导的纳米医学建立了新的范式，将病理特征转化为治疗触发器，解决了传统化疗中的精确性与毒性之间的矛盾。
引言
肝细胞癌（HCC）是一个全球性的健康危机，占原发性肝癌的75-85%，是全球癌症相关死亡率的第三大原因[[1], [2], [3], [4]]。尽管在系统治疗方面取得了进展，但晚期HCC的5年生存率仍然低于15%，这一数字几乎没有因当前的治疗范式而得到改善[5,6]。阻碍临床进展的一个核心挑战是缺乏肿瘤特异性药物递送。这导致了严重的系统毒性和肿瘤内药物积累不足，迫切需要新的分子策略来实现精准靶向[7,8]。
长期以来，人们一直在探索利用纳米载体将药物递送到肝细胞上的无唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）以实现肝脏定向治疗[[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]]。然而，这种看似直接的方法存在一个根本的设计缺陷：使用了“始终开启”的靶向配体。这种方法面临双刃剑的失败风险。首先，40-60%的HCC病例中ASGPR表达下调，使得该靶点不可靠[[16], [17], [18]]。其次，更为关键的是，持续活性的配体会被健康肝细胞无差别地摄取，导致受体饱和、快速清除以及严重的、通常是危险的肝毒性[13,19,20]。这突显了从静态靶向向能够逻辑区分健康细胞和恶性细胞的情境感知系统转变的迫切需求。最近的研究表明，HCC细胞具有独特的酶学特征，尤其是神经氨酸酶3（NEU3）的过表达，这是一种结合在质膜上的唾液酸酶，能够切割糖缀合物末端的唾液酸[[21], [22], [23]]。NEU3在HCC组织中的活性水平比邻近正常肝脏高5到8倍，它不仅是一个生物标志物，更是恶性肿瘤的功能性特征[[24], [25], [26]]。这种独特的生化差异提供了一个独特的化学机会：可以利用这种内源性酶活性作为可编程的触发器来进行治疗激活。
在这里，我们提出了一种酶控DNA纳米计算机，它作为化学逻辑门，将NEU3的过度活性转化为ASGPR参与的空间和时间控制的指令。具体来说，我们构建了一个四面体DNA纳米结构（TDN）作为可编程支架。其三个顶点被合成的寡糖（Neu5Ac-Gal-Glc）功能化，形成了一个三价展示，其中末端的唾液酸（“帽”）在空间上掩盖了内部的半乳糖（“钥匙”）。然后将化疗药物多柔比星（Dox）插入DNA框架中，得到最终的纳米计算机Dox@Capped-TDN（方案2a）。这种“糖帽”作用创建了一个生物惰性的、“锁定”状态，在系统循环过程中防止被识别。当遇到富含NEU3的HCC微环境时，唾液酸连接被酶切割——这一精确的化学事件“解锁”了系统，暴露出半乳糖配体，启动快速的ASGPR介导的内吞作用，并完成了一个两步验证级联反应，作为生物AND门。图1展示了这种NEU3门控激活逻辑的简化示意图，而详细的结构组装和实施过程则在方案2中给出。通过结合酶-底物特异性与受体-配体识别，我们的设计直接解决了靶点异质性和非靶点毒性的双重挑战。据我们所知，这是首次在基于DNA的治疗系统中使用内源性人类糖苷酶作为可编程触发器，为开发针对酶调节异常癌症的智能纳米药物提供了坚实的蓝图。
部分摘录
Dox@Capped-TDN的制备与表征
DNA纳米计算机Dox@Capped-TDN是通过精确的、分层的自组装过程设计的。选择四面体DNA纳米结构（TDN）作为核心支架，因为它具有坚固的架构和可编程的顶点（S1-S4，表S1）[27]。其中三个顶点被扩展序列功能化，使得合成的、携带寡糖的DNA链（Capped-a*）能够进行位点特异性杂交。质谱法提供了关键部分的定量验证
结论
总结来说，我们成功设计并验证了Dox@Capped-TDN，这是一种NEU3门控的DNA纳米计算机，作为精准HCC治疗的生物AND门。通过要求两个连续的分子验证事件——NEU3的酶切割 followed by ASGPR的受体结合——该系统将HCC的病理特征转化为决定性的治疗指令。这一策略在临床相关的原位模型中实现了82%的肿瘤生长抑制
材料与试剂
AML-12（RRID:CVCL_0140）和Hepa1–6（RRID:CVCL_0327）细胞系于2023年1月从中国科学院上海细胞库购买。Hepa1–6-Fluc-Neo细胞系（RRID:CVCL_RA19）于2023年6月从合肥万武生物技术有限公司（中国合肥）获得。所有细胞系均使用基于PCR的方法检测了支原体污染，并在使用前确认无污染。细胞培养试剂包括RPMI 1640和DMEM培养基
CRediT作者贡献声明
雷莉：撰写——原始草稿，方法学，形式分析。胡静：撰写——原始草稿，方法学。杨文：撰写——审稿与编辑，监督。李静英：撰写——审稿与编辑，项目管理，资金获取，概念化。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2020YFA0210800）、国家自然科学基金（22474022）、福建省杰出青年科学基金（2023J06016）和福建省自然科学基金（2021J01362）的慷慨资助。作者对这些资助来源表示衷心的感谢。
