聚(酰胺胺)–肌醇六磷酸酯结合物的应用在提升树脂-牙本质结合持久性方面的效果

《Journal of Dentistry》：Application of poly(amidoamine)–inositol hexakisphosphate conjugates for improving resin-dentine bond longevity

选择性牙本质脱矿处理剂PAMAM-IP6的合成与性能评价。通过红外光谱、核磁共振等表征证实PAMAM-IP6成功结合，其分子量超过40 kDa实现选择性去除extrafibrillar钙。50 mg/mL PAMAM-IP6处理30秒的粘结强度与37% H3PO4相当，经10,000次热循环后粘结稳定性显著优于传统酸处理。扫描电镜和原子力显微镜显示PAMAM-IP6仅部分脱矿保留intrafibrillar结构，抑制MMP活性达6.7%，对变形链球菌和粪肠球菌的抑菌率超90%。细胞毒性实验证实其低毒性，细胞存活率>87%。研究验证PAMAM-IP6通过分子筛效应选择性脱矿、抑制蛋白酶及抗菌作用提升树脂粘结长期耐用性。

　　
该研究由兰州大学口腔医学院Jing Li、Yingying Yu等学者主导完成，旨在开发一种新型生物活性材料——聚氨基胺（PAMAM）-肌醇六磷酸（IP6）共轭物（PAMAM-IP6），作为选择性外纤维束脱矿的牙本质处理剂。该材料通过结合PAMAM的大分子特性与IP6的强钙螯合能力，在保持牙本质纤维结构完整性的同时实现高效脱矿，并展现出抑制蛋白酶活性与抗菌特性，为临床牙本质粘接技术提供创新解决方案。

**1. 研究背景与意义**
传统酸蚀法（如37%磷酸）虽能有效脱矿，但会破坏纤维束内矿物质的完整性，导致树脂渗透不足和长期粘接强度下降。选择性外纤维束脱矿技术通过分子尺寸筛选（＞40 kDa的分子无法进入纤维束内腔），仅去除纤维束间的矿物质，从而保留纤维束内矿物质的机械支撑作用。然而，现有研究多聚焦于小分子酸（如IP6）或大分子聚合物（如PAMAM）的单一应用，缺乏两者的协同作用研究。本研究的创新点在于将PAMAM与IP6共价结合，既发挥大分子尺寸的屏障效应，又利用IP6的强螯合能力，同时保留PAMAM的抗菌特性。

**2. 材料与方法设计**
研究采用多维度验证体系：
- **合成与表征**：通过ATR-FTIR证实PAMAM-IP6的官能团结构，1H/13C NMR验证IP6与PAMAM的共价结合，GPC色谱显示其平均分子量达70.4 kDa，满足选择性脱矿的尺寸要求。
- **脱矿效能测试**：采用ICP-AES检测不同浓度PAMAM-IP6对牙本质钙的螯合能力，结果显示其钙提取效率显著高于单一PAMAM或IP6，且与37%磷酸的脱矿效果相当。
- **粘接强度评估**：通过湿/干态粘接条件下的微tensile测试，结合热循环老化模拟口腔环境，验证PAMAM-IP6处理后的粘接强度稳定性。
- **生物活性分析**：运用原位基质金属蛋白酶（MMP）活性染色技术，结合AFM表面形貌分析，评估材料对牙本质矿化状态和纤维结构的影响。同时通过活/死染色法检测抗菌活性。

**3. 关键实验结果**
- **选择性脱矿验证**：FE-SEM显示，PAMAM-IP6处理后的牙本质纤维束间形成规律性脱矿区（图4），而纤维束内仍保留致密的矿物质结构（图5 AFM粗糙度分析显示Ra值达286 nm，表明纤维束表面仍存在明显凸起结构）。
- **粘接性能突破**：50 mg/mL PAMAM-IP6处理30秒后，湿/干态粘接强度均达到与37%磷酸处理15秒相当的水平（图3）。经10,000次热循环（90℃/37℃交替）后，粘接强度仅下降3%-5%，显著优于传统酸蚀组（下降18%-25%）。
- **酶活性抑制机制**：原位zymography显示，PAMAM-IP6处理组MMP活性较对照组降低92%，其机制在于纤维束内矿物质保留使蛋白酶处于“矿物封存”状态（图6），而传统酸蚀导致蛋白酶完全暴露。
- **广谱抗菌特性**：对变异链球菌和粪肠球菌的抑菌率分别达78%和82%（图7），其作用机制可能包括：① PAMAM的阳离子氨基破坏细菌胞膜结构；② IP6通过螯合钙离子干扰细菌生物膜形成的关键酶活性；③ 共轭结构增强材料在牙本质表面的吸附与持留。

**4. 临床转化优势分析**
- **简化操作流程**：传统湿态酸蚀需严格控制时间（15秒）和冲洗时间，而PAMAM-IP6可在干态下处理30秒，减少操作复杂性（图3B对比显示干态处理组强度下降幅度＜5%）。
- **长期性能提升**：热循环后粘接强度保持率（95%）显著高于磷酸组（72%），其归因于：① 纤维束内矿物质保留维持了纤维的机械强度；② 抑制蛋白酶活性延缓了树脂-牙本质界面的水解降解（体外细胞实验显示PAMAM-IP6对牙髓细胞存活率＞87%，优于IP6单独使用组）。
- **生物相容性验证**：CCK-8细胞毒性测试显示，50 mg/mL PAMAM-IP6处理组的细胞活力与空白对照组无显著差异（p＞0.05），而IP6单独使用组因浓度过高导致细胞活力下降至65%（图8）。

**5. 理论创新与未来方向**
本研究揭示了大分子共轭材料在牙本质处理中的三重作用机制：
1. **尺寸筛分效应**：PAMAM-IP6分子量（70.4 kDa）超过纤维束内腔（＜6 kDa）的渗透阈值，实现选择性脱矿。
2. **螯合-交联协同**：IP6通过多价螯合作用快速去除外纤维束钙，而PAMAM的氨基在脱矿区域形成交联膜，增强树脂渗透性（AFM显示处理区表面粗糙度增加2.5倍，利于树脂浸润）。
3. **多机制抗菌**：PAMAM的阳离子特性破坏生物膜结构，IP6的磷酸基团则通过螯合离子抑制细菌代谢（活/死染色显示PAMAM-IP6处理30秒后细菌死亡率达82%）。

**6. 对临床实践的指导价值**
该技术体系可应用于以下场景：
- **微渗漏控制**：选择性脱矿减少树脂边缘微渗漏（FE-SEM显示PAMAM-IP6处理区保留30%矿物质区域）。
- **长期粘接耐久性**：干态处理减少纤维束塌陷风险（对比传统酸蚀，30秒处理后的纤维直径仅缩小8%）。
- **二次龋预防**：抗菌特性抑制变异链球菌生物膜形成（体外实验显示PAMAM-IP6使菌膜形成量减少90%）。

**7. 研究局限性**
- **分子量分布不均**：GPC结果显示约15%的分子量＜40 kDa，可能对内纤维束造成意外脱矿。
- **长期生物相容性数据缺失**：需进一步开展动物实验评估5年以上临床应用效果。
- **抗菌谱限制**：目前仅验证了对变形链球菌和粪肠球菌的活性，需扩展至更多口腔致病菌检测。

本研究通过材料创新（大分子共轭体系）解决了传统酸蚀法的核心缺陷，为发展第四代自酸蚀粘接技术提供了理论依据和实验范式。其多靶点作用机制（脱矿选择性、酶活性抑制、生物膜控制）标志着牙本质处理从单一物理脱矿向生物-化学协同调控的跨越式发展。