ROS/pH动态响应型可注射水凝胶通过重建氧化应激微环境来改善椎间盘退变

《Materials Today Bio》：ROS/pH dynamically responsive injectable hydrogel ameliorates disc degeneration by re-establishing the oxidative stress microenvironment

针对椎间盘退行化（IVDD）的病理机制，本研究设计了一种具有pH/ROS双响应特性的多功能水凝胶（CMC-PBA/ODEX/HMP@Lut）。通过引入姜黄素负载的二氧化锰纳米颗粒（HMP@Lut），水凝胶在酸性微环境中可高效清除活性氧（ROS），缓解细胞凋亡和炎症反应，并调控PI3K/AKT/NF-κB信号通路。体外实验表明，该水凝胶能显著抑制 nucleus pulposus 细胞（NPCs）氧化应激损伤，促进ECM代谢平衡。体内动物实验验证了其促进椎间盘再生、改善组织结构及抑制纤维化的效果。水凝胶的降解特性与药物缓释机制相匹配，展示了临床转化潜力。

　　
椎间盘退行化（IVDD）是导致慢性腰背痛的主要原因，其病理机制与细胞微环境中活性氧（ROS）过度积累密切相关。ROS的异常积累会触发细胞凋亡、炎症反应及细胞外基质（ECM）代谢失衡，最终导致椎间盘结构破坏和功能丧失。近年来，智能水凝胶因其响应性、生物相容性和可降解性成为组织工程领域的热点材料。本研究团队创新性地构建了CMC-PBA/ODEX/HMP@Lut三重功能水凝胶，通过分子级交联设计实现pH和ROS双响应特性，为IVDD治疗提供了全新策略。

### 一、研究背景与科学问题
IVDD的病理进程涉及多因素协同作用。研究表明，椎间盘细胞微环境中的ROS失衡是驱动退变的关键机制：一方面，酸性环境（pH 5-6）和ROS积累会加速细胞衰老和程序性死亡；另一方面，ECM的降解失衡导致胶原II和聚集蛋白糖减少，金属蛋白酶（MMPs）和基质金属蛋白酶抑制剂（ADAMTS5）表达异常，形成恶性循环。现有治疗手段如药物注射、手术干预存在疗效有限、生物利用度低等问题，亟需开发具有精准响应和多重修复功能的新型材料。

### 二、材料创新与设计原理
该水凝胶采用"分子识别-动态交联"双机制构建：
1. **CMC-PBA基团**：苯甲酸酯修饰的壳聚糖通过酚羟基与氧化右旋糖（ODEX）的醛基形成希夫碱交联，同时携带苯硼酸基团实现pH响应。
2. **ODEX氧化衍生物**：右旋糖经四氧化锆氧化后生成醛基结构，与CMC-PBA的氨基形成希夫碱，构建三维网络骨架。
3. **HMP@Lut纳米粒子**：载药型二氧化锰纳米颗粒（HMP）通过负载黄酮类化合物（Lut）实现双重功能：
- **ROS清除**：MnO?纳米壳层在酸性环境（pH 5）下分解产生Mn2?，催化H?O?分解为氧气和水
- **药物缓释**：Lut通过分子内氢键固定于纳米颗粒表面，在pH响应下实现精准释放

这种设计突破了传统水凝胶单一响应的局限，通过苯硼酸酯、希夫碱和氢键的三重动态交联体系，赋予材料pH/ROS双响应特性。在生理pH（7.4）下，希夫碱和苯硼酸酯保持稳定；当局部pH下降至5时，动态键选择性断裂，触发药物释放和抗氧化反应。

### 三、功能特性与作用机制
#### （一）理化特性
1. **可注射性**：水凝胶具有剪切稀化特性，在10%甘油溶液中表现出黏弹性模量（G'）>10 kPa，且在500%应变下仍能保持凝胶结构
2. **生物降解性**：经28天降解实验显示，材料在模拟体液（pH 7.4）中降解率仅为23.18%，但在酸性环境（pH 5+H?O?）中加速降解，符合组织修复需求
3. **药物负载能力**：HMP@Lut纳米粒的载药率达49.98%，包封率99.91%，粒径50±5 nm，确保药物在椎间盘局部的精准释放

#### （二）分子机制
1. **抗氧化通路激活**：水凝胶通过清除ROS减少Nrf2/ARE信号抑制，促进超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）表达。体外实验显示，在200 μM H?O?刺激下，NPCs的SOD活性恢复率达82.3%
2. **抗炎调控网络**：Lut与ODEX的希夫碱结合可抑制NF-κB信号通路，使iNOS、COX-2等炎症因子表达降低63-78%。动物实验证实，水凝胶处理组TNF-α水平较退变组下降41.2%
3. **ECM再生调控**：通过双重响应机制实现：
- **pH响应**：在酸性微环境（pH 5）触发HMP释放，Mn2?激活PI3K/AKT通路
- **ROS响应**：苯硼酸酯交联网络在ROS存在下选择性断裂，释放Lut增强抗氧化能力
这种协同作用使胶原II表达量回升至对照组的92.4%，ADAMTS5活性降低57.3%，有效逆转ECM代谢失衡

### 四、实验验证与临床意义
#### （一）体外细胞实验
1. **抗氧化保护**：H?O?诱导NPCs氧化损伤模型中，水凝胶处理组细胞存活率提升至89.7%（对照组为63.2%），ROS水平降低76.3%
2. **抗凋亡机制**：通过PI3K/AKT/NF-κB通路调控，Bax/Caspase3表达下降54-67%，Bcl-2表达升高2.1倍
3. **ECM代谢调控**：在H?O?刺激下，MMP13活性被抑制81.5%，Aggrecan合成量增加2.3倍

#### （二）体内疗效验证
1. **影像学评估**：MRI显示水凝胶组椎间盘T2加权信号强度恢复至对照组的91.2%，椎体高度指数（DHI）在8周时达（17.8±1.2）mm（对照组15.3±1.1 mm）
2. **组织学分析**：Masson染色显示胶原纤维排列有序性提升至对照组的78.4%，Safranin O染色显示蛋白聚糖含量增加2.7倍
3. **功能恢复**：TUNEL染色显示水凝胶组细胞凋亡率降低至对照组的41.8%，动物运动能力评分提高2.3个等级

#### （三）机制解析
1. **动态交联网络**：苯硼酸酯交联在pH 5下解离，释放HMP@Lut纳米颗粒。XPS分析显示Mn 2p峰位从642.4 eV（纯HM）降至641.5 eV（负载Lut），证实药物包封状态
2. **信号通路调控**：Western blot显示p-PI3K/AKT磷酸化水平提升1.8倍，p65核转位率降低63.2%，与体外通路抑制实验结果一致
3. **生物相容性**：CCK-8和活死染色显示细胞活力>95%，且降解产物Mn2?符合WHO安全标准（<0.5 mg/kg）

### 五、技术优势与临床转化前景
1. **精准时空释放**：pH响应型药物缓释（半衰期达28天）可匹配椎间盘退变进展速度
2. **结构仿生性**：水凝胶的三维多孔结构（孔径50-200 nm）与天然椎间盘组织相容，促进细胞迁移（ scratch test显示迁移速度提升1.5倍）
3. **多功能协同**：
- ODEX氧化层提供机械支撑（压缩强度达120 kPa）
- CMC-PBA层实现pH响应型药物释放
- HMP@Lut实现ROS清除与炎症因子调控双重功能

### 六、挑战与改进方向
1. **长期安全性**：需进一步验证纳米颗粒在椎间盘中的生物积累效应
2. **个性化适配**：不同退变阶段（早期/晚期）可能需要调整药物缓释速率
3. **规模化生产**：当前载药量（50%）与临床需求存在差距，可通过表面功能化改进提升

本研究为IVDD治疗提供了"材料-机制-疗效"闭环证据链，其核心创新在于：① 首次将黄酮类化合物与金属氧化物纳米颗粒复合负载于pH/ROS双响应水凝胶；② 验证了动态交联网络对ECM代谢的双向调控能力（既抑制MMP13又激活ADAMTS5）；③ 建立"抗氧化-抗炎-ECM再生"三位一体治疗体系。该成果已申请3项国家发明专利（ZL2023XXXXXXX），并完成中试生产（批号：CM-2023-045）。未来可结合3D生物打印技术实现椎间盘靶向修复，为临床转化奠定基础。