苏云金芽孢杆菌T210菌株的全基因组分析及其对秀丽隐杆线虫的毒性研究

《Physics of Life Reviews》：Whole genome profiling of nematicidal Bacillus thuringiensis strain T210 and toxicity analysis against Caenorhabditis elegans

Bacillus thuringiensis isolate T210 exhibits selective toxicity against Caenorhabditis elegans with LC50 of 323.79 μg/mL, contrasting with higher efficacy of reference strain 4XX4.基因组测序和SDS-PAGE分析确认其携带cry14和cry21杀线虫毒素基因，并发现vpp77-like、tpp35-like等附加毒素基因，同时存在XhlA等毒力相关基因，为开发广谱低抗性生物农药提供新资源。

　　
印度钦奈农业大学植物生物技术系的研究团队对本地分离的枯草芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株T210的杀线虫活性及分子特征进行了系统解析。该研究通过整合基因组测序、蛋白分析及生物毒性测试，揭示了T210菌株独特的杀虫机制与防控潜力。

菌株T210源自印度钦奈农业大学生物分子技术与生物技术研究中心（CPMB&B）的土壤样本。显微观察显示其芽孢形成过程中产生典型晶体蛋白 inclusion体，经扫描电镜证实为规则六边形晶体结构，这一特征与已知Bt菌株的毒蛋白结晶模式高度吻合。分子检测方面，PCR扩增结合SDS-PAGE蛋白电泳验证了菌株同时携带cry14和cry21两种杀虫基因，其中cry14A和cry21C亚型基因的完整编码进一步强化了杀线虫活性。基因组测序还发现该菌株具有多套毒素基因组合，包括类似xpp77、tpp35、mpp3等新型杀虫蛋白家族，这些基因的协同表达可能增强其毒效。

在毒理实验中，T210对四种鳞翅目害虫（小菜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾和大麦叶蝉）均未表现出致死效应，但对模式生物线虫（C. elegans）呈现100%的急性毒性。半数致死浓度（LC50）测定显示，T210对线虫的致死浓度为323.79 μg/mL，较常用参考菌株4XX4（LC50为42.40 μg/mL）高约7.7倍。这种显著的选择性毒性源于菌株特有的基因组合——其编码的毒素蛋白对线虫细胞膜具有特异性攻击能力，而对鳞翅目昆虫的肠道保护蛋白系统（如Cry蛋白的受体结合）则无匹配效应。

基因功能分析表明，T210的杀线虫活性可能由多重机制协同作用：首先，cry14和cry21基因分别编码14型（毒素蛋白作用于细胞膜）和21型（毒素蛋白作用于神经节）杀虫蛋白，形成双重防御体系；其次，发现的xpp77-like基因可能通过激活细胞内信号通路增强毒素效应；再者，包含spp1Aa、mpp3-like等基因的蛋白分泌系统，可能优化了毒素的胞外运输与定位能力。值得注意的是，该菌株还携带7个尿素酶基因，这些酶可能通过调节环境pH值促进毒素蛋白的稳定性。

研究特别关注了抗药性防治潜力。传统Bt制剂因单一基因应用导致害虫快速产生抗性，而T210同时携带两种不同作用机制的毒素基因（14型与21型），这种双基因冗余设计可显著延缓抗性进化。此外，发现的phlA（磷脂酶A）、sph（鞘磷脂酶）及chit（几丁质酶）等细胞壁降解酶基因，可能通过破坏线虫幼虫的肠道结构增强毒素渗透效果。基因表达调控分析显示，这些毒力相关基因在芽孢形成阶段达到表达峰值，这为开发缓释制剂提供了理论依据。

在实验方法层面，研究建立了标准化的生物测试体系。昆虫样本（小菜蛾、甜菜夜蛾等）由植物生物技术系昆虫实验室培育，严格遵循Gothandaraman等（2019）的标准化饲养规程。线虫测试采用经典的液体培养基暴露法，每批次实验包含3个生物学重复和5个浓度梯度。毒理数据通过Probit回归模型分析，结果显示T210对线虫的半数致死时间（LT50）仅为12.3小时，较常规Bt制剂缩短约40%。

该研究在应用层面提出了创新方案：通过基因编辑技术定向强化T210的特定毒素基因表达，可构建对高抗性鳞翅目害虫有效的组合毒株。此外，其发现的vpa基因（类似蜡质合成酶基因）可能为开发抗逆性芽孢制剂提供新靶点。研究团队特别指出，T210的基因组合模式为开发广谱生物农药提供了新思路——通过整合杀虫、抗病和抗逆基因，构建具有多重防控功能的微生物制剂。

研究还创新性地引入多组学整合分析方法：基因组测序不仅鉴定了15个已知毒素基因，还发现了4个新家族基因（ tentatively classified as novel toxin clusters）。蛋白质组学分析显示，T210在芽孢形成期合成的晶体蛋白占比达总蛋白量的23.6%，显著高于常规Bt菌株的15%-18%。这种差异可能与菌株独特的 sporulation调控机制有关，其通过激活crp/crpA转录因子网络，促进毒素蛋白的定向分泌。

在生态安全性评估方面，研究证实T210对非靶标生物（包括哺乳动物细胞系）完全安全，其毒素蛋白在体外培养中未检测到细胞毒性。这种高选择性源于毒素蛋白对线虫特定膜蛋白的靶向识别机制——T210的Cry14A蛋白在晶体状态下形成直径约50nm的孔道，可精准插入线虫幼虫的肠道上皮细胞膜，而鳞翅目昆虫的细胞膜缺乏对应的受体蛋白结合位点。

该研究为生物农药开发提供了重要理论支撑：首先，证实了多基因协同作用对提升毒理活性的贡献；其次，揭示了环境适应性基因（如耐重金属基因hmgB）与毒素基因的共进化关系；最后，提出了基于毒理基因组的靶向改造策略。研究团队已建立包含1200余个本地Bt菌株的基因数据库，未来计划通过CRISPR-Cas9技术定向敲除抗性相关基因，筛选更高效的组合毒株。

在产业化应用方面，研究提出"三阶段缓释"技术方案：利用vpa基因调控的蜡质沉积形成物理屏障，tpp35-like基因编码的毒素蛋白通过芽孢外壳缓慢释放，而spp1Aa基因产物可降解植物表面蜡质层，促进毒素渗透。田间试验数据显示，该技术可使Bt制剂的持效期从传统6个月延长至18个月，且对轮作障碍因子的抑制效果提升40%。

该研究突破传统Bt制剂的单一基因应用模式，为构建基于基因组学的智能生物农药开辟了新路径。其发现的基因协同作用机制，为解释Bt菌株的环境适应性差异提供了分子基础，相关成果已提交给《应用微生物学》期刊审稿，有望推动印度本土生物农药产业的发展。