对抗火疫病的斗争：新型噬菌体的特性研究 ——土耳其发现的两种新型Erwinia amylovora噬菌体的基因组与生物学特征分析

《Physics of Life Reviews》：Fighting Fire Blight: Characterization of Novel Bacteriophages Against Erwinia amylovora in Turkiye Genomic and Biological Characterization of Two Novel Erwinia amylovora Phages from Türkiye

噬菌体EAP2和EAP4可有效抑制火疫病病原菌Erwinia amylovora，不同感染剂量下抑菌效果差异显著，为区域化生物防治提供新方案

　　

Eylul Evran | Emine Kubra Tayyarcan | Kubra Guven | Esra Ekiz | Esra Acar Soykut | Metehan Ar?kan | Emre Keskin | Ismail Hakki Boyaci

哈切特佩大学（Hacettepe University），食品工程系，贝伊特佩（Beytepe），安卡拉（Ankara），土耳其

摘要

火疫病由Erwinia amylovora引起，是一种具有破坏性的疾病，导致全球范围内严重的经济损失和食物浪费。现有的控制策略往往效果有限，依赖有害化学物质，并且加剧了抗生素耐药性的出现。因此，迫切需要可持续且有效的替代方法。其中，噬菌体具有许多优势，如对宿主细菌的高度特异性和最小的环境影响，是一种有前景的生物控制手段。使用本地细菌进行噬菌体分离会影响这种治疗的成功率。在这项研究中，从土耳其分离出了两种名为EAP2和EAP4的噬菌体，并对其在针对火疫病的田间管理中的潜在用途进行了表征。这两种噬菌体的基因组大小分别为85.7 kb和86.2 kb，其 contigs 长度分别为11,199 bp和10,495 bp。形态分析显示，这两种噬菌体都拥有一个大的二十面体头部，连接着一个长尾部。此外，它们的潜伏期为30分钟，EAP2和EAP4在每个感染细胞中的释放量分别为66.7 PFU和100.0 PFU。效力测试表明，在感染复数（MOI）从0.1到10的范围内，这两种噬菌体都能显著减少E. amylovora的数量。当MOI为0.1时，EAP2使细菌数量减少了1.57个对数单位；而当MOI为10时，EAP4使细菌数量减少了1.16个对数单位。总体而言，这些结果突显了本地分离的噬菌体作为有效且可持续的生物控制剂，在特定地区农业系统中管理火疫病的强大潜力。

引言

火疫病由Erwinia amylovora引起，是一种影响梨、苹果及其他Rosaceae科植物的严重细菌性疾病。该疾病传播迅速，可以在一个生长季节内杀死单株树木甚至整个果园，从而造成巨大的经济损失[1]。这是一种传染性疾病，其症状会出现在宿主植物的不同部位，包括枝条、叶片、花朵和果实[2]。感染后，树木最初会呈现水浸状，随后变为深绿色、棕色甚至黑色[3]。一旦发生感染，由于病原体的快速系统传播，管理变得极其困难。

迄今为止，化学物质是田间控制火疫病的常用方法。频繁且无限制地使用抗生素和含铜化学物质会导致耐药菌株的出现，使得疾病控制更加困难[4]。此外，过量使用含铜化学物质还会导致环境中化学物质的积累，从而引发耐铜菌株的出现，并对动植物及人类健康造成不良影响[4]、[5]、[6]、[7]。因此，控制火疫病是一个全球性的重要问题，需要有效的控制方法。

噬菌体是一种专门感染细菌的病毒，最近在包括兽医、医学、食品安全和环境生物技术[8]、[9]、[10]以及植物保护[11]、[12]、[13]等多个领域受到了关注。噬菌体应用具有多个优势，如宿主特异性、最小的生态影响以及较低的耐药性发展潜力[14]。先前的研究表明，噬菌体混合物能够在体外和体内显著减少E. amylovora的数量和火疫病症状[11]；Schwarczinger, Kolozsváriné Nagy, Künstler, Szabó, Geider, Király 和 Pogány [15]。然而，耐药菌株的出现凸显了持续分离和表征新的、适应当地环境的噬菌体的必要性[16]。

在土耳其，火疫病仍然是苹果和梨生产的主要威胁。对化学控制的持续依赖加剧了细菌群体的耐药性，并加剧了环境退化。鉴于病原体在不同地区的动态变化，本地分离的噬菌体可能提供更有效和可持续的控制方法。因此，本研究旨在分离并表征在土耳其果园中普遍存在的E. amylovora菌株EA1和EA4的本地噬菌体。进行了包括宿主范围确定、吸附率、一步生长曲线和透射电子显微镜（TEM）在内的全面分析。此外，还进行了体外时间杀菌实验以评估分离噬菌体的抗菌效果。这些结果可能有助于开发针对特定地区的、环境友好的火疫病生物控制策略。

章节摘录

E. amylovora细菌的分离与鉴定

从土耳其萨卡里亚（Sakarya）果园中表现出火疫病症状的苹果树上分离出了Erwinia amylovora菌株。使用King’s medium B和Levan琼脂进行细菌分离[17]。收集来自枝条、叶片和果实的组织，并将其浸泡在含有聚维酮（PVP-10，20 g）、抗坏血酸（1.76 g）、还原型谷胱甘肽（3 g）、甘露醇（10 g）和磷酸盐缓冲盐水（10 mM，pH 7.2；1 L）的浸渍缓冲液中30分钟[18]

细菌的分离与鉴定

E. amylovora菌株EA4和EA1是从苹果果园中分离出来的，它们是火疫病的致病菌。通过16S rRNA分析鉴定这些分离的细菌[30]、[35]。分析结果与GenBank数据库进行了比较，发现分离的细菌序列与GenBank中的MG839255.1菌株有99.92%的相似性（EA1）和100%的相似性（EA4）。核糖体RNA的部分序列已存入GenBank，访问号为

讨论

E. amylovora是影响果园的最具破坏性的病原体之一，是全球许多国家火疫病爆发的原因。这种疾病难以控制，传统的控制策略主要依赖抗生素（例如链霉素）和含铜化合物[36]。然而，这些物质的广泛和长期使用导致了耐药菌株的出现，大大降低了它们的有效性[37]。

结论

在这项研究中，从土耳其的感染果园中分离出了E. amylovora噬菌体，并对其在体外条件下的不同感染复数（MOI）下的活性进行了评估，结果表明较高的MOI值能更有效地减少细菌数量。这些噬菌体具有狭窄的宿主范围，表明它们可以在不干扰果园自然微生物群的情况下用于火疫病的生物控制。进一步分离和表征噬菌体，并进行详细的应用研究，

作者贡献声明

Emine Kubra Tayyarcan： 方法学、研究、概念化。Eylul Evran： 写作——初稿、方法学、研究、概念化。Esra Ekiz： 写作——审稿与编辑、方法学、研究。Kubra Guven： 写作——审稿与编辑、方法学、研究。Metehan Ar?kan： 写作——初稿、方法学。Esra Acar Soykut： 写作——审稿与编辑、监督。Emre Keskin： 写作——审稿与编辑、监督。Ismail Hakki BOYACI： 写作——审稿与

伦理批准

本研究不需要伦理批准。

利益冲突声明

作者没有与本文内容相关的利益冲突需要声明。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向通讯作者提出合理请求后获得。

资助

Esra Ekiz和Kubra Guven获得了土耳其科学技术研究委员会（The Scientific and Technological Research Council of Turkey）提供的2211/A通用国内博士奖学金计划的支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

TEM分析是在土耳其安卡拉中东技术大学（Middle East Technical University, METU）中央实验室的120 kV（FEI Tecnai G2 Spirit BioTwin CTEM）设备上进行的。