《Translational Research》：ZONAB regulates renal cyst formation in
nphp1 knockout mice
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ZONAB通过调控CCND1和PCNA促进Nephronophthisis肾囊肿形成及小管扩张。在nphp1 KO小鼠模型中，肾囊肿细胞显著高表达ZONAB、CCND1和PCNA，敲低ZONAB可抑制囊肿形成及小管扩张，并降低相关增殖标志物表达。
Jiayong Lai|XiaoYa Wei|Dantong Li|Xiaohong Wu|Yaqing Liu|Huamu Chen|Zhihui Yue|Liangzhong Sun
南方医科大学南方医院儿科，中国广州510515
摘要
肾小管扩张和皮质-髓质交界处的囊肿形成是肾髓质发育不良（NPH）的典型病理特征，可能与疾病进展有关。然而，NPH中肾囊肿形成的具体机制尚不清楚。细胞增殖的增加是囊肿形成的必要条件。ZONAB是一种与紧密连接相关的转录调控因子，能够靶向CCND1和PCNA等增殖相关因子。在本研究中，我们探讨了ZONAB在nphp1敲除（nphp1KO）小鼠中肾囊肿形成中的作用及其可能的机制。我们发现nphp1KO小鼠的肾组织中ZONAB、CCND1和PCNA的表达水平升高，但这些表达主要局限于肾囊肿细胞。ZONAB的敲低抑制了肾囊肿的形成和肾小管扩张，并降低了nphp1KO小鼠中CCND1和PCNA的表达。因此，我们推断ZONAB可能通过调控CCND1和PCNA在NPH的肾囊肿形成中起重要作用。
引言
肾髓质发育不良（NPH）是一种常染色体隐性遗传性囊性和间质性肾病，是儿童终末期肾病（ESRD）的主要遗传原因。^1^, ^2^ 目前，已有超过20个与该疾病相关的致病基因被鉴定出来。^3, 4, 5^ nphp1是其中最常见的致病基因，该基因编码nephrocystin-1，这种蛋白定位于初级纤毛的过渡区和细胞连接处。^6^ nphp1的突变会导致NPH I型（NPH1）。NPH的病理特征包括肾小管扩张和皮质-髓质交界处的囊肿形成、肾小管基底膜的增厚和分层、弥漫性肾纤维化以及炎症。^7^ 大约50%的患者存在肾囊肿，通过影像学检查可以观察到这些囊肿；在未检测到肾囊肿的情况下，病理检查也可能发现微小囊肿。^8^ 然而，NPH中肾囊肿形成的具体机制仍不明确。
研究表明，在常染色体显性多囊肾病（ADPKD）和NPH中，细胞增殖的增加都促进了囊肿的形成。在ADPKD中，肾囊肿细胞中观察到与增殖相关的转录因子（如cyclin D1（CCND1）、Ki67和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达上调。^9, 10, 11^ 一些NPH致病基因的缺失也与细胞增殖增加有关。inv（nphp2）的缺失或突变会导致肾小管上皮细胞的持续增殖。^12, ^13^ 具有ANKS6缺陷的增殖患者来源细胞中Ki-67阳性核的数量显著增加，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）检测也显示细胞增殖增强，但这些现象在静止细胞中并未观察到。^14^ 通过单核测序发现，nphp1敲除（nphp1KO）小鼠的肾囊肿细胞中CCND1和PCNA的表达水平升高，而非囊肿细胞中则没有这种变化，这表明肾囊肿细胞中的增殖活性增强。然而，NPH1肾囊肿细胞中CCND1和PCNA表达上调的具体机制仍不清楚。
ZONAB（HGNC批准的基因符号：YBX3；OMIM 603437）是一种与zonula occludens-1（ZO-1）相关的核酸结合蛋白，在细胞增殖和分化过程中发挥关键的转录调控作用。该基因的表达在活跃增殖的细胞中显著升高，该分子与含有反向CCAAT序列的特定启动子结合，从而调控与细胞增殖相关的因子（如PCNA和CCND1）的转录。^16, 17, 18^ ZONAB是连接紧密连接的的关键转录调控因子。^19^ 在细胞连接良好的细胞中，ZONAB被紧密连接相关蛋白ZO-1和ZO-2限制在细胞连接处，从而限制其进入细胞核。我们之前的研究观察到nphp1的敲低会干扰细胞连接的形成，并促进MDCK细胞中ZONAB的表达和核转位。^20^ 在三维（3D）培养的犬远端肾小管上皮细胞（MDCK细胞）中，ZONAB的下调显著降低了细胞增殖，而其过表达则降低了MDCK细胞的分化潜能。^19, ^22^ 尚未探讨ZONAB是否调控NPH中CCND1和PCNA的表达以及肾囊肿的形成。
在本研究中，我们利用之前由我们团队成功建立的nphp1KO小鼠模型，探讨了ZONAB对肾囊肿形成的影响及其潜在机制。我们发现NPH1小鼠的肾囊肿细胞中ZONAB、PCNA和CCND1的水平升高，ZONAB的敲低抑制了肾囊肿的形成并降低了囊肿细胞中PCNA和CCND1的表达。这些结果表明ZONAB在NPH1的肾囊肿形成中起重要作用，其效应可能通过PCNA和CCND1介导。
实验方法
小鼠
C57BL/6J小鼠饲养在南方医科大学南方医院的SPF动物实验室中，环境温度控制在21°C，湿度为50%-55%，光照周期为12小时/12小时。食物和水供应充足。所有动物实验均经过南方医科大学南方医院动物实验伦理委员会的审查和批准（申请编号：NFYY-2020-0830）。nphp1基因敲除小鼠模型由我们的研究团队构建。
通过尾静脉注射AAV9
nphp1KO小鼠肾囊肿细胞中ZONAB、CCND1和PCNA的表达升高
组织病理学分析显示，5周时nphp1KO小鼠的肾小管扩张轻微，未观察到明显的囊肿形成。12周时，在皮质-髓质交界处观察到多个大小不一的囊肿以及肾小管扩张。36周时肾间质纤维化明显，72周时纤维化进一步加重（补充图1A）。12周龄nphp1KO小鼠肾组织中的ZONAB mRNA水平与对照组无显著差异。
讨论
细胞增殖是囊性肾病中肾囊肿形成的基本过程，尽管其具体机制尚未完全明了。在ADPKD和常染色体隐性多囊肾病（ARPKD）中，上皮细胞增殖的增加对肾囊肿的形成至关重要。^29, 30, 31, 32^ 本研究发现，nphp1KO小鼠的肾组织中ZONAB、CCND1和PCNA的表达水平升高，尤其是在肾囊肿细胞中。
作者贡献声明
所有作者均阅读并批准了最终稿件。
数据可用性
本研究的数据支持结果详见论文。如需更多相关数据，可联系作者获取。
作者贡献声明
Jiayong Lai：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构思。XiaoYa Wei：实验实施、数据管理。Dantong Li：方法学设计、实验实施、数据管理。Xiaohong Wu：实验实施、数据管理。Yaqing Liu：方法学设计、数据管理。Huamu Chen：方法学设计、数据管理。Zhihui Yue：撰写、审稿与编辑、项目监督、资源协调、方法学设计、数据管理、概念构思。Liangzhong Sun：撰写——
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：81470913）和广东省自然科学基金（项目编号：2022A1515012307）的支持。
