短肠综合征临床前模型中肝损伤与自噬功能受损相关

《Scientific Reports》：Liver injury in a preclinical model of short bowel syndrome is associated with impaired autophagy

本研究针对短肠综合征（SBS）并发肠衰竭相关性肝病（IFALD）的机制，探讨了自噬在其中的作用。研究人员通过小鼠小肠大部切除术（SBR）模型，发现SBR小鼠出现显著肝损伤，并伴有自噬关键受体p62/SQSTM1的积累。进一步的自噬流定性分析和单核RNA测序揭示，肝损伤与自噬功能受损相关，其潜在机制可能与PI3K-Akt-ErbB信号通路汇聚激活mTORC1有关。该研究为理解IFALD的发病机制提供了新视角，并提示mTORC1可能成为潜在治疗靶点。

　　

当人们因为克罗恩病、肠系膜血管栓塞或创伤等原因，不得不接受大面积的小肠切除手术后，一种名为短肠综合征（Short Bowel Syndrome, SBS）的严重状况便可能随之而来。患者赖以生存的营养吸收能力大打折扣，而更雪上加霜的是，一种被称为肠衰竭相关性肝病（Intestinal Failure-Associated Liver Disease, IFALD）的并发症常常如影随形。过去，IFALD常被归咎于长期肠外营养的支持治疗，但越来越多的证据表明，其病因远比想象中复杂，肠道本身的缺失、肠道菌群的紊乱、胆汁酸代谢的异常都可能参与其中。尽管科学家们已经知道肝脏会因此受损，出现内质网应激和线粒体功能障碍，但细胞内部一个至关重要的“清洁回收”系统——自噬（Autophagy），在IFALD中的作用却一直是个谜。自噬是细胞在应激状态下，通过形成自噬体将受损的细胞器、错误折叠的蛋白质等“垃圾”运送至溶酶体进行降解回收的过程，对维持细胞健康至关重要。那么，在短肠综合征引发的肝损伤中，自噬系统是过度劳累，还是功能不彰？这个问题成为了美国圣路易斯华盛顿大学Jun Guo和Brad W. Warner团队关注的焦点。他们的最新研究成果《Liver injury in a preclinical model of short bowel syndrome is associated with impaired autophagy》发表在《Scientific Reports》上，首次揭示了自噬功能受损是IFALD肝损伤的一个关键特征，并指出了其背后可能的分子开关。

为了回答这个问题，研究人员主要运用了几项关键技术：他们建立了成熟的小鼠75%近端小肠切除术（SBR）模型来模拟人类短肠综合征及相关的肝损伤；通过血清学检测、肝脏组织病理学评分（采用NASH临床研究网络NAS CRN系统）和分子生物学方法（如RT-qPCR、Western Blot）评估肝损伤和自噬相关标志物（如p62）的表达；利用腺病毒介导的GFP-LC3II感染原代肝细胞并进行饥饿诱导，通过共聚焦显微镜进行自噬流的定性分析；对肝脏组织进行单核RNA测序（snRNA-seq），结合生物信息学分析（如KEGG、GSEA）来探索不同细胞群体的转录组特征和潜在信号通路；并通过免疫组织化学（IHC）对关键蛋白（如p-S6）进行定位和半定量分析。

SBR导致特征性的身体形态学改变和肝损伤

研究人员首先确认了SBR小鼠模型的可靠性。与假手术（Sham）对照组相比，SBR小鼠术后出现了特征性的体重下降，并在2-3周后达到最低点，随后在8周内缓慢恢复。身体成分分析显示，SBR小鼠体脂百分比降低，瘦体重增加。肠道方面，SBR小鼠表现出典型的适应性改变，即残留小肠的绒毛高度增加。更重要的是，SBR小鼠在术后2周和10周均表现出明显的肝损伤证据：血清转氨酶（AST、ALT）水平升高，肝脏组织学评分（NAS CRN评分）显示脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变等特征，天狼星红染色证实了10周时出现肝纤维化。此外，内质网应激标志物Ddit3和氧化应激标志物Nqo1的mRNA表达在SBR小鼠肝脏中也持续上调。这些结果证实，该模型成功模拟了SBS相关的肝损伤。

SBR相关肝损伤以自噬失调为特征

为了探究自噬的作用，研究人员检测了自噬受体p62（由Sqstm1基因编码）的表达。p62在自噬过程中负责将泛素化的货物招募到正在形成的自噬体膜上，其积累通常提示自噬流受阻。免疫组化、Western Blot和RT-qPCR结果一致表明，无论在雄性还是雌性SBR小鼠的肝脏中，p62的mRNA和蛋白水平在术后2周和10周均显著高于对照组。这一发现强烈提示SBR后肝脏的自噬功能可能受损。

单核RNA测序揭示SBR后肝细胞中mTORC1激活的潜在机制

为了更深入地了解自噬受损的机制，研究人员对术后2周的雄性小鼠肝脏进行了单核RNA测序。分析结果揭示了一个在SBR肝脏中显著增多的肝细胞亚群（标记为簇5肝细胞）。引人注目的是，这个亚群的肝细胞表现出最高的p62（Sqstm1）基因表达。对簇5肝细胞的差异表达基因进行分析后发现，与假手术组相比，SBR组的该簇肝细胞在ErbB信号通路和PI3K-Akt通路相关的基因上显著富集。值得注意的是，这两条通路均可汇聚激活mTORC1（雷帕霉素机制靶标复合体1）。而mTORC1的激活是自噬起始的关键负调控因子。基因集富集分析（GSEA）进一步显示，这些肝细胞中与核糖体生物合成相关的基因集被激活，而肝脏代谢相关基因集被抑制，这间接支持了mTORC1可能被激活的假设，因为mTORC1正调控蛋白质翻译和核糖体生成。

mTORC1在SBR肝细胞中被激活

基于生物信息学的发现，研究人员通过免疫组化检测了mTORC1活化的下游标志物——磷酸化核糖体蛋白S6（p-S6）的表达。结果显示，在术后2周和10周，无论是雄性还是雌性SBR小鼠的肝脏中，p-S6的阳性染色面积均显著高于对照组，这表明mTORC1信号通路在SBR后肝脏中被持续激活。

讨论

本研究首次在短肠综合征相关的肝损伤模型中系统地揭示了自噬功能受损的现象。通过p62积累这一替代标志物、直接的自噬流观察以及单核转录组学分析，研究人员提供了多重证据，表明自噬过程，特别是其诱导阶段，在SBR后肝脏中受到抑制。生物信息学分析和免疫组化验证共同将矛头指向了PI3K-Akt-mTORC1信号通路的激活，这可能是导致自噬抑制的关键上游事件。

其重要意义在于，它将短肠综合征后可能发生的多种病理生理改变（如脂质吸收改变、内毒素易位、内质网应激和氧化应激）与细胞内稳态的核心调控机制——自噬联系了起来。研究人员推测，肠道切除后，脂质代谢紊乱和肠道菌群产物可能通过门静脉系统直接冲击肝脏，导致脂毒性、内质网应激和线粒体损伤，这些应激原本应激活自噬进行修复，但mTORC1的异常激活可能“关闭”了自噬的启动开关，使得损伤累积，最终导致肝损伤。这一发现为IFALD的机制研究开辟了新的方向。尽管本研究存在自噬检测为定性、机制探索尚属间接关联等局限性，但它为后续研究，例如使用mTORC1抑制剂进行药理干预以恢复自噬并减轻肝损伤，提供了坚实的理论基础和令人信服的初步证据。未来，靶向自噬通路或许能成为预防和治疗IFALD的一种新策略。