SNIPE：基于DNA序列的细胞筛选新方法实现无标记精确基因组编辑

《Nature Communications》：Search-and-remove genome editing allows selection of cells by DNA sequence

基因组编辑常需标记基因筛选细胞，但标记基因可能产生非预期生理效应且不兼容单核苷酸编辑。为此，研究人员开发了名为SNIPE（选择性核酸酶诱导纯度增强）的无标记筛选技术。该方法通过CRISPR引导RNA识别未编辑细胞DNA序列，并联合抑制非同源末端连接（NHEJ）和微同源介导末端连接（MMEJ）通路，特异性清除未编辑细胞。实验表明，SNIPE可将精确编辑效率中位数提高7倍，成功应用于人类和黑猩猩诱导多能干细胞、42个靶点编辑，并能富集尼安德特人祖先型突变及清除癌细胞突变。该技术为精准医学和进化研究提供了强大工具。

　　

在生命科学和医学研究领域，基因组编辑技术如CRISPR-Cas9的革命性突破，为精准修改遗传信息提供了强大工具。然而，尽管编辑工具本身不断优化，一个长期存在的瓶颈问题是如何高效地从大量细胞中筛选出成功携带目标编辑的细胞。目前主流方法依赖于共转入抗生素抗性基因或荧光蛋白基因作为筛选标记。这些标记基因犹如给细胞贴上的“条形码”，虽然便于识别，却可能“弄巧成拙”——它们可能整合到基因组不当位置，干扰内源基因功能，或表达外源蛋白影响细胞正常生理状态。更棘手的是，对于单核苷酸编辑这种最精细的遗传修饰，传统标记方法完全无用武之地。此外，低效率的编辑，特别是大片段基因敲入，往往需要耗费大量时间和资源通过单细胞克隆筛选理想细胞，这个过程不仅效率低下，还可能引入克隆间变异。因此，开发一种不依赖外源标记、能够根据DNA序列本身进行高效筛选的新技术，成为基因组编辑领域迫切的需求。

德国马克斯·普朗克进化人类学研究所的Stephan Riesenberg团队及其合作者在《自然·通讯》上发表了一项创新性研究，他们开发了一种名为“选择性核酸酶诱导纯度增强”的方法，简称SNIPE。这项技术巧妙地利用了CRISPR系统本身的特点，实现了仅基于DNA序列差异的无标记细胞筛选，为基因组编辑领域提供了强大新工具。

研究人员为开展此项研究，主要运用了几项关键技术：首先，他们利用CRISPR-Cas系统（包括Cas9-HiFi、Cas12a等变体）进行靶向DNA切割；其次，通过小分子抑制剂M3814抑制DNA-PKcs（非同源末端连接NHEJ的关键蛋白）和siRNA靶向POLQ mRNA（抑制微同源介导末端连接MMEJ）来阻断易错修复通路；再者，采用了多种基因编辑策略，如引物编辑、碱基编辑和同源定向修复；此外，研究还涉及了人类和黑猩猩诱导多能干细胞等多种细胞模型，并通过Illumina测序、液滴数字PCR等技术进行基因型验证和脱靶效应评估。

“SNIPE”：选择性核酸酶诱导纯度增强

SNIPE的核心原理相当巧妙：任何破坏gRNA识别位点的基因编辑（即使是单核苷酸变化）都会使编辑后的细胞对后续CRISPR切割产生抗性。研究人员将gRNA区分编辑与未编辑细胞DNA序列的能力，与同时抑制NHEJ和MMEJ相结合。这种双重抑制阻止了在未编辑细胞中形成插入/缺失突变，而是引导细胞走向凋亡，从而选择性清除未编辑细胞，富集编辑细胞。

SNIPE与抗生素选择的比较

研究团队首先将SNIPE与最先进的抗生素选择方法进行了直接比较。他们在人诱导多能干细胞中设计了一个实验：通过引物编辑修复嘌呤霉素抗性基因中的终止密码子。编辑后，细胞群体被分成两部分，分别用SNIPE和嘌呤霉素进行筛选。结果表明，SNIPE将携带正确编辑的细胞比例从25%提高到84%（增加3.2倍），效果与1μg/ml嘌呤霉素筛选（达到87%）相当，但细胞死亡率更低（SNIPE为27%，嘌呤霉素为37%）。使用更高浓度嘌呤霉素虽可提高筛选纯度至96%，但导致96%的细胞死亡，毒性极大。

选择目标点突变

研究团队测试了不同NHEJ和MMEJ抑制剂组合（如M3814与POLQ siRNA混合、M3814与PolQi2、AZD7648与PolQi2）对SNIPE效率的影响。发现M3814与POLQ siRNA混合使用在提高编辑效率（如FANCF位点从20%增至73%）和减少大规模染色体异常方面表现最佳。随后，他们在VEGFA、HEK3等多个基因位点测试了SNIPE，发现SNIPE不仅能提高精确编辑效率（中位数提高7倍），还能提高“结果纯度”（即目标编辑在所有编辑事件中的比例）。值得注意的是，SNIPE对双等位基因编辑有强烈富集作用，并能有效减少脱靶编辑。

多重富集单核苷酸编辑

研究人员挑战了更复杂的任务——同时引入五个错义突变，将现代人基因变体恢复为尼安德特人和丹尼索瓦人共有的祖先状态。他们通过多轮引物编辑和SNIPE筛选，最终从116个单细胞克隆中获得了25个（22%）在所有10条染色体（5个基因，二倍体）上均携带全部五个目标编辑的细胞系。这展示了SNIPE在复杂多重编辑中的强大富集能力。

选择大片段敲入

大片段DNA（如全长基因）的精确敲入在iPS细胞等多数细胞类型中效率很低。研究人员测试了SNIPE在提高大片段敲入效率方面的作用。他们将0.9至4.5kb不等的转录因子编码序列敲入AAVS1安全港位点。结果显示，SNIPE将敲入效率从中位数水平提高了3.4倍，平均效率达到70%，对于某些转录因子，甚至所有生成的克隆都携带目标敲入。

利用SNIPE选择性杀伤携带癌症突变的培养细胞

SNIPE的原理——清除未编辑细胞——启发研究团队探索其反向应用：选择性杀伤携带特定基因突变（如癌症突变）的细胞，而保留野生型细胞。他们首先在混合培养体系中证明了SNIPE可以有效富集野生型p53细胞，清除携带TP53突变的细胞。更重要的是，在靶向慢性髓系白血病K562细胞特有的BCR-ABL融合基因（费城染色体标志）时，SNIPE能特异性杀伤约一半的K562细胞，而不影响不携带该融合基因的THP-1细胞。最令人惊喜的发现是，在靶向杂合性癌症细胞系（如RD-ES、HT-29、HuCC-T1，分别携带TP53 R273C、APC E853*、KRAS G12D杂合突变）的致病等位基因时，SNIPE不仅清除了部分携带突变的细胞，还在存活细胞中显著提高了野生型等位基因的频率。研究人员推测，SNIPE在致病等位基因上引入的双链断裂，可能被细胞以同源染色体上的野生型序列为模板进行修复，从而实现了对癌症突变的内在“修复”。

综上所述，这项研究开发的SNIPE技术，通过巧妙的“搜索并清除”策略，将CRISPR的精确靶向能力与DNA修复通路调控相结合，建立了强大的无标记细胞筛选平台。它不仅显著提高了单核苷酸编辑和大片段敲入的效率与纯度，实现了多重复杂编辑，还展现出在疾病建模、癌症细胞选择性清除乃至潜在“修复”致病突变方面的广阔应用前景。由于SNIPE不依赖外源DNA模板进行筛选，还可能减少由DNA损伤反应引发的细胞衰老和炎症等副作用。尽管在推向体内应用前，仍需仔细评估其安全性（如大规模染色体异常的风险），但SNIPE无疑为基因组编辑和细胞治疗领域提供了一种极具价值的通用型工具，推动基础研究向临床应用迈出更坚实的一步。该技术的高效性和序列特异性特点，使其在合成生物学、疾病模型构建和精准医疗等领域具有巨大的发展潜力。