冠状病毒校对核酸外切酶（ExoN）的结构与催化多样性：揭示MERS-CoV与SARS-CoV-2的关键差异

《Nature Communications》：Structural and catalytic diversity of coronavirus proofreading exoribonuclease

本研究针对不同冠状病毒的RNA校对核酸外切酶（ExoN）在结构和催化特性上的差异尚不明确的问题，通过比较MERS-CoV与SARS-CoV-2的ExoN，结合冷冻电镜结构和生化分析，首次揭示了MERS-CoV ExoN活性显著低于SARS-CoV-2，并鉴定出决定其广谱底物特异性的关键残基H95和N104。该研究为开发靶向ExoN的广谱抗冠状病毒药物提供了重要理论基础。

　　

冠状病毒，特别是SARS-CoV-2和MERS-CoV（中东呼吸综合征冠状病毒），对全球公共卫生构成了持续且重大的威胁。这些病毒的成功复制和传播，很大程度上依赖于其自身一套精密的分子机器。其中，病毒RNA（核糖核酸）的复制过程虽然高效，但其依赖的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）却有一个致命的弱点——容易出错，即在合成新RNA链时错误地插入核苷酸。如果这些错误（突变）大量积累，将会导致病毒基因组失活，最终使病毒消亡。为了解决这个问题，冠状病毒演化出了一种独特的“校对”机制，其核心执行者是一种名为核酸外切酶（ExoN）的酶。ExoN能够像“橡皮擦”一样，从RNA链的末端开始切除错误的核苷酸，从而保证病毒基因组的复制 fidelity（保真度）。不仅如此，ExoN还能降解病毒复制过程中产生的双链RNA（dsRNA）中间体，这些中间体容易被宿主的先天免疫系统识别并触发抗病毒反应，因此ExoN也帮助病毒实现“免疫逃逸”。由于ExoN对所有冠状病毒的存活都至关重要，它成为一个极具吸引力的广谱抗病毒药物靶点。

然而，目前对ExoN的理解主要基于对SARS-CoV和SARS-CoV-2（两者同属sarbecovirus亚属）的研究。对于其他重要的冠状病毒，例如属于merbecovirus亚属的MERS-CoV，其ExoN的结构和功能特性是否相同，是否存在差异，这些差异又意味着什么，此前都是未知的。这种认知上的空白阻碍了针对多种冠状病毒的通用抑制剂的开发。

为了填补这一关键空白，由Yu Li, Xiaocong Cao, Lauren M. Recker, Yang Yang和Chang Liu组成的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们首次对MERS-CoV和SARS-CoV-2的ExoN进行了系统的比较研究，旨在揭示冠状病毒ExoN家族的结构和催化多样性。研究人员综合运用了冷冻电子显微镜（cryo-EM）单颗粒分析技术解析蛋白质-RNA复合物结构，以及多种生物化学分析手段（包括酶动力学测定、RNA切割活性分析、荧光偏振结合实验）来定量评估酶的活性和底物偏好。他们成功解析了MERS-CoV ExoN与多种不同3‘末端核苷酸（胞苷C、尿苷U、腺苷A、鸟苷G）的dsRNA底物结合的冷冻电镜结构，这是首次获得sarbecovirus亚属之外冠状病毒的ExoN结构。同时，他们详细比较了MERS-CoV和SARS-CoV-2 ExoN的催化效率和底物特异性。

研究结果显示，MERS-CoV ExoN的整体催化活性显著低于SARS-CoV-2 ExoN。尽管两者与RNA底物的结合亲和力（K_M值）相近，但SARS-CoV-2 ExoN的催化效率（k_cat/K_M）远高于MERS-CoV ExoN。结构分析揭示了造成这一差异的关键原因：MERS-CoV ExoN活性中心的一个关键环（α4-α5 loop，其上携带催化残基H268）的构象与SARS-CoV-2 ExoN不同。在MERS-CoV ExoN中，H268距离切割位点的磷酸基团和推测的催化水分子更远，这种构象类似于未结合RNA的“失活”状态，导致其催化活性较低。

另一方面，研究也发现两种冠状病毒的ExoN对底物RNA的序列具有广谱的降解能力，但它们对不同核苷酸表现出明显的偏好性。无论是MERS-CoV还是SARS-CoV-2的ExoN，都最容易消化3‘末端为错配胞苷（U:C错配）的RNA，其次是末端为A或U的RNA，而对末端为正确配对的C或G的RNA消化速度最慢。这种偏好性与解开不同碱基对所需的能量以及ExoN对核苷酸的特异性识别有关。

通过分析高分辨率结构，研究人员鉴定出nsp14（ExoN结构域所在蛋白）上的两个残基——H95和N104，是ExoN能够广谱识别并有效切除不同核苷酸的关键决定因素。H95通过其灵活的咪唑环侧链，能够以不同的方式与所有四种标准核苷酸的碱基形成氢键。N104则通过与RNA底物中倒数第二个核苷酸（-1位置）的核糖和碱基形成特异性相互作用，帮助稳定底物结合。突变实验证实，将H95或N104突变为丙氨酸（A）或天冬氨酸（D）后，ExoN对各种RNA底物的切割活性均显著下降，证明了这两个残基对于ExoN行使校对和免疫逃避功能至关重要。

结构及催化活性

研究人员首先解析了MERS-CoV ExoN（使用催化失活突变体E191A）与含有3‘末端U:C错配的茎环RNA（T20P15）复合物的冷冻电镜结构（分辨率2.7 ?）。结构显示，ExoN通过其浅的dsRNA结合口袋捕获并破坏了RNA末端的错配碱基对，使+1C_P核苷酸正确定位于活性中心。活性中心有一个Mg²⁺离子与催化残基D90、E92、D273以及底物的磷酸基团配位。然而，与SARS-CoV-2 ExoN相比，MERS-CoV ExoN中携带H268的α4-α5 loop构象不同，导致H268远离切割位点，这可能是其活性较低的结构基础。

结构及催化差异

通过将MERS-CoV ExoN·RNA复合物结构与SARS-CoV-2的对应结构进行叠合比较，研究人员确认了二者活性中心构象的关键差异。MERS-CoV ExoN的H268位置相较于SARS-CoV-2 ExoN有3.3 ?的偏移。生化动力学分析进一步证实，MERS-CoV ExoN的转换数（k_cat）和催化效率（k_cat/K_M）均远低于SARS-CoV-2 ExoN，而二者的米氏常数（K_M）相近，表明差异主要源于催化步骤而非底物结合。Mg²⁺浓度实验排除了二价离子偏好不同是导致活性差异的原因。

核苷酸识别

为了解ExoN如何识别不同的3‘末端核苷酸，研究人员解析了MERS-CoV ExoN与末端分别为A、U、G、C（错配）的RNA复合物结构（分辨率均为2.9 ?）。结构分析表明，ExoN对所有四种核苷酸的2’-OH和3‘-OH基团的识别模式是保守的。关键在于nsp14 H95，其侧链可以通过形成氢键与所有四种碱基相互作用，其灵活的构象旋转赋予了ExoN广谱的底物识别能力。对于鸟嘌呤（G），H95需要采取一种较低几率的构象才能与之结合，这部分解释了ExoN对3‘末端为G的RNA活性最低的原因。

底物偏好

定量的RNA切割实验和荧光偏振结合实验证实，两种ExoN对含有不同3‘末端核苷酸的RNA底物具有一致的偏好顺序：U:C错配 > A:U或U:A配对 > G:C正确配对 > C:G正确配对。这种偏好性与解开末端碱基对所需的能量以及ExoN对核苷酸的特异性识别效率直接相关。

广谱底物特异性的结构决定因素

功能实验表明，将H95或N104突变会显著削弱ExoN对所有测试RNA底物的切割活性，证明了它们在ExoN广谱功能中的关键作用。特别是N104D突变对含有-1C_T、-1A_T或-1U_T的RNA切割活性抑制更为明显，结构建模表明突变后的D104难以与这些碱基形成稳定相互作用，而仍可能以某种方式与-1G_T作用，这解释了其影响的不均匀性。

本研究首次在原子水平上揭示了MERS-CoV ExoN的结构特征，并通过与SARS-CoV-2 ExoN的详细比较，阐明了冠状病毒ExoN在催化活性和底物识别上的保守性与多样性。研究发现，尽管来自不同亚属的冠状病毒ExoN可能因其活性中心局部构象的差异而表现出不同的催化效率，但它们都依赖于H95和N104这两个高度保守的残基来实现对多种RNA底物的广谱降解能力。这种广谱性对于ExoN行使其双功能——即无偏好性地降解病毒dsRNA以逃避免疫监视，以及校正RNA合成中可能掺入的任何错误核苷酸——至关重要。该研究不仅增进了我们对冠状病毒复制和免疫逃逸机制的基本认识，更重要的是，它所揭示的ExoN结构和机制细节，特别是关键的保守残基，为未来设计能够有效抑制多种冠状病毒（包括当前流行毒株和潜在新发毒株）ExoN活性的广谱抗病毒药物提供了宝贵的理论依据和结构蓝图。研究结果提醒我们，即使在同一病毒家族中，核心酶的功能也可能存在重要差异，未来针对重要病毒靶点的研究需要涵盖更广泛的病毒物种，以指导真正有效的泛病毒疗法开发。