内源性血清IgG4普遍发生Fab臂交换，极大拓展抗体分子多样性

《Nature Communications》：Widespread Fab-arm exchange affects all endogenous serum IgG4

本研究针对IgG4抗体在体内Fab-arm exchange(FAE)的普遍性及程度这一关键问题，通过开发基于LC-MS的IgG4克隆谱分析技术，揭示了健康人血清中所有内源性IgG4均发生广泛且随机的FAE，导致其分子多样性呈指数级爆炸式增长，为理解IgG4在过敏、自身免疫及抗体药物研发中的作用提供了全新视角。

　　

在人体复杂的免疫系统中，免疫球蛋白G（IgG）是体液免疫的主力军。它包含四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。尽管它们结构相似，序列同源性超过90%，但功能上却各具特色。其中，IgG4堪称“异类”。它最独特的性质是能够进行Fab臂交换（Fab-arm exchange, FAE）。简单来说，一个完整的IgG4抗体分子可以“一分为二”，变成两个“半分子”（每个包含一条重链和一条轻链），然后这些半分子又能与其他IgG4的半分子随机“配对”，重新组合成新的、双特异性抗体。这种机制使得IgG4抗体理论上可以拥有两个不同的抗原结合位点，从而可能影响其功能，例如在过敏反应或某些自身免疫性疾病中起到免疫调节或抑制作用。

然而，尽管FAE现象已被发现多年，一些关键问题仍未得到明确解答：在真实的生理环境下，例如在人的血液中，究竟有多少比例的IgG4分子参与了FAE？是所有IgG4克隆都“一视同仁”地参与交换，还是某些克隆更“偏爱”交换？FAE过程是随机的，还是存在某种偏好性？回答这些问题对于深入理解IgG4的生物学功能至关重要，尤其是在IgG4相关性疾病（IgG4-RD）、使用IgG4作为骨架的抗体药物（如一些免疫检查点抑制剂）以及某些疫苗接种后出现强效IgG4反应的背景下。此前的研究大多依赖于单个的单克隆抗体，难以全面反映体内复杂多样的内源性IgG4群体的真实行为。缺乏能够同时、高通量分析血清中所有IgG4克隆的技术手段，是阻碍该领域发展的主要瓶颈。

为了解决这一难题，来自荷兰乌得勒支大学、桑昆研究所和莱顿大学医学中心的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项重要研究。他们开发了一种创新的液相色谱-质谱（LC-MS）方法，首次实现了对健康人血清中内源性IgG4克隆 repertoire（即所有不同克隆的集合）的高分辨率分析。他们的研究得出了一个惊人的结论：Fab臂交换在血清中广泛存在，并且以一种随机的、普遍的方式影响着几乎所有的内源性IgG4分子。这种广泛的交换导致血清中IgG4分子的多样性远超其他IgG亚类，呈现出“爆炸式”增长。

关键技术方法概述

研究人员首先从健康捐赠者（共7名，其中一名在16个月内采集7次进行纵向研究）的血清中，使用IgG4特异性亲和树脂纯化总IgG4。随后，使用IdeS蛋白酶（又称FabRICATOR）在所有IgG亚类的铰链区下方进行酶切，释放出Fab2（由两个Fab片段通过铰链区二硫键连接）和Fab（单个Fab片段）片段。通过尺寸排阻色谱（SEC）分离这两种片段，并分别进行完整蛋白质水平的LC-MS分析。为了解析极其复杂的Fab2群体，研究还对Fab2和Fab片段进行化学还原，生成轻链（Lc）和含可变区的重链片段（Fd），再进行LC-MS分析，从而在更简单的水平上比较克隆组成。此外，还进行了体外FAE诱导实验以验证体内观察到的现象。

研究结果

IgG4铰链区酶切独特地产生两个不同的质量群体

研究人员首先比较了IdeS酶切不同IgG亚类（使用重组CD20靶向单抗7D8的IgG1, IgG2, IgG3, IgG4版本）以及从血清中亲和纯化的内源性IgG1和IgG4后的产物。结果显示，IgG1、IgG2和IgG3仅产生完整的Fab2片段（约98 kDa），而IgG4则同时产生Fab2和Fab（约49 kDa）两个明显的群体。这证实了IgG4分子以共价连接（形成Fab2）和非共价连接（在酶切后解离为Fab）两种结构异构体形式共存。对健康捐赠者血清的分析表明，内源性IgG4中，共价连接的Fab2分子平均约占77.6%（标准差3.9%），非共价连接的Fab分子约占22.4%，这一比例在不同个体间非常稳定。

血清中几乎所有IgG4克隆都经历了Fab臂交换

接下来，研究人员试图通过LC-MS分析SEC分离后的Fab2和Fab片段的克隆组成。他们发现，Fab片段的LC-MS图谱清晰可辨，能检测到数百个克隆。然而，来自同一样本的Fab2片段的LC-MS图谱却几乎检测不到完整的蛋白质信号。他们推测，这是由于广泛的FAE导致了巨大的复杂性。如果血清中存在n个高丰度的IgG4 Fab半分子（即n个独特的克隆），那么通过随机FAE形成的双特异性IgG4 Fab2分子的种类将高达(n + k - 1)种（k为样本大小），导致每个特定Fab2分子的丰度被极度稀释，从而无法被检测到。为了验证这一假设，他们将Fab2和Fab片段还原成Lc和Fd片段。还原后，Fab2和Fab片段产生的Lc和Fd repertoire 在组成和丰度上几乎完全相同。这一关键证据强有力地表明，FAE影响了血清中所有的IgG4克隆，并且交换过程是全面的，使得原始的Fab2群体复杂性极高，而还原后则回溯到了相对简单的半分子库。

Fab臂交换是血清IgG4中的随机现象

为了进一步验证FAE的随机性，研究人员系统比较了来自同一捐赠者同一份血清样本的还原后Fab2 fraction和Fab fraction中的Lc和Fd克隆谱。对7名健康捐赠者（共26对样本）的分析显示，在同一个体内，还原后的Fab2和Fab fraction的克隆 repertoire 无论是在组成还是片段丰度上都高度相似。这种高度一致性为FAE在体内是一个随机过程提供了直接证据，表明没有特定的IgG4克隆更倾向于或更抵抗交换。此外，对一名捐赠者长达16个月的纵向追踪显示，其IgG4克隆谱具有很高的时间稳定性，表明在缺乏免疫挑战的情况下，个体内的主要IgG4克隆可以长期存在。

研究结论与意义

这项研究通过创新的蛋白质组学方法，首次在克隆分辨率上揭示了内源性血清IgG4的全局性行为。其主要结论是：Fab臂交换是健康个体血清中所有内源性IgG4普遍经历的一个基本随机的过程。这一过程导致功能性IgG4抗体分子的多样性出现指数级增长，远超其他IgG亚类，可能使IgG4成为人体内分子多样性最丰富的抗体类别。

这项研究具有多重重要意义：

1. 1.
   深化对IgG4生物学的理解：它证实了长期以来关于FAE随机性的假设，并将其从对单个单克隆抗体的观察推广到整个内源性IgG4群体。
2. 2.
   解释IgG4的独特功能：广泛随机FAE产生的双特异性IgG4分子可能通过“抗原交联”阻断等机制，在抑制过度免疫反应（如过敏、寄生虫感染）中发挥关键作用。
3. 3.
   指导IgG4抗体药物的研发与评估：许多治疗性抗体（如纳武利尤单抗、帕博利珠单抗）使用IgG4骨架以避免不必要的效应功能。本研究提醒，天然IgG4的FAE特性可能导致药物与内源性IgG4发生交换，产生未知的双特异性分子，可能影响药物的稳定性和疗效。目前常用的S228P突变（模拟IgG1铰链区）正是为了抑制FAE，但这使得药物分子不再代表天然的IgG4。
4. 4.
   提供新的研究方法：所开发的LC-MS克隆谱分析技术为研究其他涉及IgG4的领域（如IgG4自身免疫性疾病、IgG4相关性疾病、mRNA疫苗接种后强烈的IgG4反应）提供了强大的工具。

总之，这项研究解决了IgG4生物学中一个长期存在的核心问题，描绘了血清IgG4分子景观的惊人复杂性，为未来在基础免疫学和临床医学中更精准地理解和利用IgG4奠定了坚实的基础。