克隆细胞状态揭示胃食管连接部组织与化生及癌症的谱系关联

《Nature Communications》：Clonal cell states link gastroesophageal junction tissues with metaplasia and cancer

本研究针对Barrett's食管(BE)的细胞起源和癌变机制这一难题，通过结合单细胞谱系追踪和转录组分析技术，对来自患者化生及健康组织的细胞进行了深入研究。意外发现连接食管鳞状上皮、胃贲门和连接处过渡基底细胞的谱系，并证实BE由多个克隆构成，而癌前病变则起源于单个分子异常克隆的扩张。该研究为理解BE的细胞动力学提供了单细胞水平的见解，揭示了从组织起源到癌症的疾病轨迹。

　　

当胃食管遭遇"身份危机"——揭秘Barrett's食管的前世今生

在日常的消化门诊中，许多长期受胃酸反流困扰的患者可能会面临一种特殊的病理变化：原本应该由鳞状上皮覆盖的食管下段，竟然出现了类似于胃或肠道的柱状上皮。这种被称为Barrett's食管(Barrett's Esophagus， BE)的化生现象，不仅是消化系统常见的病变类型，更是食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma， EAC)的明确癌前病变。然而，尽管其临床重要性毋庸置疑，科学界对BE的细胞起源和癌变机制的认识仍存在大量空白。

化生本质上是组织对损伤的一种适应性反应，即正常细胞类型被其他"外来"细胞类型所取代。正是这种细胞"身份"的彻底转变，使得研究者难以追溯这些化生细胞的"前世今生"，确定它们最初来自何种组织。在BE的案例中，长期酸暴露被认为导致食管鳞状细胞被类似胃和肠的柱状细胞替代，但关于BE的起源细胞究竟是什么，它是由单个细胞还是多个细胞扩张形成，以及单个祖细胞是否能产生BE中的所有细胞类型等问题，长期以来一直争议不断。

更令人担忧的是，与其他化生组织一样，BE可能进一步发展成癌症。然而，驱动这种恶性转化的早期分子事件和具体参与的细胞类型仍不完全清楚。传统的谱系追踪方法，如基于报告基因的小鼠模型，虽然提供了一些线索，表明化生可能起源于胃贲门、食管或胃食管连接部本身的多种祖细胞，但这些动物研究结果能否直接推及人类仍存疑问。而在人类组织中进行谱系追踪则面临更大挑战：要么依赖对批量样本中体细胞突变测序，缺乏单细胞分辨率；要么通过激光捕获显微切割分离单个隐窝或细胞，但难以处理大量细胞。

正是为了突破这些技术瓶颈，解开BE起源和演进之谜，由Rodrigo A. Gier和Sydney A. Bracht领衔的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们创新性地将单细胞谱系追踪与转录组分析相结合，对来自胃食管连接部患者的细胞进行了深入分析，首次在单细胞水平揭示了BE的细胞动力学全景。

关键技术方法

本研究收集了13名BE患者的食管鳞状上皮、BE组织和胃贲门的夹取活检样本，主要采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)线粒体变异富集技术，通过检测线粒体DNA(mtDNA)突变作为天然谱系标记。同时利用空间转录组技术(seqFISH和多重杂交链式反应)验证细胞类型定位，并针对不典型增生病例进行了全外显子测序分析体细胞突变。开发了零膨胀β二项式(ZIBB)模型严格鉴定高质量变异，通过独立单核苷酸变异(SNV)分析验证谱系分配准确性。

胃食管连接部组织可与BE克隆相关

研究团队首先对胃食管连接部不同组织进行了单细胞分析。

研究人员在6名患者中捕获到了跨越不同组织的突变，包括食管鳞状上皮与BE共享的突变、食管鳞状上皮与胃贲门共享的突变，以及胃贲门与BE共享的突变。重要的是，携带这些mtDNA变异的细胞仍保持与其组织身份一致的表达谱。这一发现表明，食管鳞状上皮和胃贲门的不同组织可能源自同一克隆，而这些克隆可以产生BE。

对距离胃食管连接部不同位置采集的系列活检分析显示，大多数谱系仅限于单一组织类型，但也有一些谱系跨越多个组织。在13号患者中，突变6150G>A出现在五个独立活检中，包含食管鳞状上皮和胃贲门细胞，且该突变也存在于最近被证明天然存在于鳞柱交界处并能产生BE样组织的过渡基底细胞中。有趣的是，携带6150G>A突变的细胞比例在靠近胃食管连接部的活检中最高，在较远位置的活检中较低，提示祖先细胞起源于连接处或附近，后代细胞从此位置迁移而出。

BE由具有多种细胞类型的多个克隆组成

为了解BE在不典型增生发展中的作用，研究人员首先需要表征其细胞类型并研究其克隆组织。对11名患者的BE活检进行scRNA-seq和线粒体变异富集分析发现，成熟的BE细胞类型（如成熟分泌细胞和吸收细胞）以及OLFM4⁺细胞在数据中得到充分体现。此外，还发现了包括簇细胞、纤毛细胞和清晰可辨的BEST4⁺细胞在内的其他细胞类型，这些特殊群体在之前的BE单细胞表征中未被检测到，突出了本研究更深层次采样揭示的组织内额外细胞多样性。

重要的是，在任何BE活检中均未观察到奠基克隆，取而代之的是由多个离散谱系组成的较小细胞亚群。将谱系叠加到注释的UMAP上后发现，每个谱系在很大程度上与样本整体相似，无论是存在的细胞类型还是它们的相对比例。这种显著的分化潜能得到了大量未成熟细胞存在的支持。

通过空间转录组学技术，研究人员进一步绘制了这些细胞类型在组织内的定位图。

研究发现吸收细胞位于腺管腔面，胃小凹细胞和杯状细胞常见于腺体中部；内分泌细胞更靠近腺体基部，那里丰富的祖细胞产生上面的分化细胞类型。值得注意的是，纤毛细胞特异性定位于食管鳞状上皮和BE腺体的边界，提示它们在这些组织的连接处可能发挥作用。

单个分子异常细胞可启动BE的恶性转化

鉴于BE包含多个谱系，研究人员进一步探究了在向不典型增生转变过程中是一个谱系还是多个谱系参与其中。在一例高级别不典型增生患者的活检中，scRNA-seq显示出两个大的上皮细胞簇：一个簇由表达已知BE细胞类型标记的细胞构成，而另一个则不然，反而显示PIGR和FAM3D的显著缺失——这两种蛋白是肠屏障完整性的已知调节因子。

引人注目的是，该患者的不典型增生组织起源于一个含有mtDNA突变15153G>A的单个细胞的扩张。ZIBB模型鉴定出部分非不典型增生BE细胞与不典型增生细胞属于同一谱系，证实不典型增生起源于BE。在这一显性谱系中，研究人员进一步观察到一个大的不典型增生亚克隆的出现，该亚克隆在UMAP空间中受到空间限制。这种克隆扩张并非孤例；另一名低级别不典型增生患者也含有类似的克隆扩张模式。

对克隆群体间的差异基因表达分析发现，不典型增生起源克隆具有独特的转录特征，多个基因包括TPM2、FAU、PCBD1和APCDD1显示一致上调。不典型增生细胞中LGR5⁺细胞丰度大幅增加，这是不典型增生进展的一个已知特征。更令人惊讶的是NOTUM以及其他WNT拮抗剂在一部分不典型增生细胞中的表达。对WNT通路组分的进一步分析揭示了不典型增生细胞中广泛的失调，包括WNT拮抗剂的上调和可能驱动竞争性克隆动态的复杂细胞间信号网络。

全外显子测序除了证实DNA中线粒体突变的存在外，还揭示了CDKN2A和TP53的突变——这两个基因最常与不典型增生和食管腺癌相关。此外，正如研究人员假设的那样，在APC的突变聚集区存在一个截短突变，APC是一种负向WNT调节因子。这一结果提出了一种可能性：该患者的不典型增生细胞可能是由一种最近在结肠腺瘤中发现的新机制驱动的，即APC突变干细胞分泌NOTUM，从而抑制并淘汰邻近的野生型干细胞。

研究结论与意义

这项研究将谱系解析的scRNA-seq应用于人类胃食管连接部样本，在疾病的每个阶段都发现了重要的生物学现象。食管鳞状上皮和胃贲门细胞彼此相关，也与BE相关，同时还与鳞柱交界处发现的过渡基底细胞相关。BE是一个多克隆组织，其中单个细胞可以产生多种成熟的特化细胞类型。此外，BE可以通过一个WNT激活克隆的扩张单克隆转化为不典型增生。

本研究结果凸显了谱系信息在连接不同细胞状态方面的价值。结合谱系追踪与scRNA-seq使研究人员能够展示BE向癌症的转化可能是由具有独特异常细胞状态的级联克隆扩张引起的。BE样本中多个离散谱系的观察应在现有BE克隆进化文献背景下解读。单细胞分辨率提供了这些谱系如何对应特定细胞状态的见解，而不同疾病阶段之间克隆动态的显著区别代表了具有潜在临床意义的重要发现。

这项工作促进了对胃食管连接部细胞可塑性的更广泛认识。跨越组织类型的谱系通过共享的祖先细胞将它们彼此联系起来。在连接处附近捕获到的这些细胞比例最高，表明祖先细胞位于连接处或附近。然而，一个重要考量是这些谱系可能不明确包含祖细胞，因为携带突变的干细胞可能未被活检采样到。因此，包含多种组织类型的谱系解释是它们共享一个祖先细胞，而不是一个组织的分化细胞转化成了另一个组织的分化细胞。

虽然研究实现了谱系追踪的单细胞分辨率，但谱系本身的分辨率仍存在限制。使用mtDNA突变作为细胞谱系标记依赖于突变的获取来提供谱系分辨率。未来，预计会出现新的组织单细胞谱系追踪方法，以改进这些分辨率限制。

BE的起源及其向食管腺癌的转化是复杂现象。研究在两个分析的不典型增生样本中观察到了克隆扩张的证据。在详细检查的案例中，这种扩张可以从BE细胞通过一种WNT失调机制追溯。对更大队列的研究需要调查BE-不典型增生谱系关系和所涉及特定分子通路的普遍性。TCGA分析证实这种细胞状态与食管腺癌相关，但仅在一部分病例中如此。虽然这一结果代表了化生中疾病进展的一条途径，但很可能只是众多途径之一。

这项研究进一步支持了一种日益增长的认识：相关表型状态（如正常组织向BE，或BE向癌症）之间的路径并不总是遵循单一轨迹。即使分析更多人类样本的研究也永远不会是穷尽的，它们的价值在于为特定细胞状态在维持和连接我们只能推测的表型中的作用提供了确凿证据。就BE而言，这些关系具有重要的临床意义，而早期方法难以解决。这项工作进一步证明了在疾病中追踪不同细胞状态克隆的普遍实用性，并证明其不仅适用于胃食管连接部，而且适用于整个人体的更广泛应用是合理的。