环状RNA circATF6通过破坏蛋白质稳态触发钙超载与EGFR-TKI协同抑制非小细胞肺癌耐药细胞

《Cell Reports》：circATF6 triggers calcium overload to synergize with EGFR-TKI in non-small cell lung cancer via modulation of proteostasis

本研究针对EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌(NSCLC)过程中出现的药物耐受持久性(DTP)细胞这一关键临床难题，发现环状RNA circATF6在DTP细胞中特异性下调。机制研究表明，circATF6通过结合内质网分子伴侣BiP/GRP78，抑制未折叠蛋白反应(UPR)，破坏蛋白质稳态，诱导内质网碎片化和Ca2+超载，最终触发DTP细胞凋亡。采用脂质纳米颗粒(LNP)递送circATF6可显著增强EGFR-TKI疗效，为克服靶向药物耐药提供了新型RNA治疗策略。

　　

在非小细胞肺癌(NSCLC)的靶向治疗领域，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)如奥希替尼(Osi)虽然初期疗效显著，但药物耐药性问题始终是困扰临床治疗的主要瓶颈。近年来研究发现，药物耐受持久性(DTP)细胞作为耐药形成过程中的关键中间状态，通过非遗传机制在药物治疗压力下存活下来，成为肿瘤复发的"种子细胞"。这些细胞具有可逆性、休眠性等特点，能够逃避药物杀伤，最终导致获得性耐药的发生。因此，探寻DTP细胞的脆弱性靶点，开发有效清除DTP细胞的策略，对于延长EGFR-TKI疗效、预防耐药发生具有重要意义。

针对这一挑战，南京医科大学的研究团队在《Cell Reports》上发表了最新研究成果，发现了一种名为circATF6的环状RNA在调控DTP细胞命运中的关键作用。研究人员通过转录组测序发现，circATF6在DTP细胞中特异性下调，而其亲本基因ATF6的表达则呈现相反趋势。这种差异表达并非由药物浓度差异引起，而是由于RNA编辑酶ADAR1的调控所致。

为了探究circATF6的治疗潜力，研究人员构建了条形码标记的慢病毒文库，通过体内外实验筛选发现，circATF6能够显著增强Osi对DTP细胞的杀伤效果。机制深入研究显示，DTP细胞在药物压力下通过激活未折叠蛋白反应(UPR)来维持蛋白质稳态，从而促进细胞存活。而circATF6通过直接结合内质网分子伴侣BiP/GRP78的ATP酶结构域，阻碍了BiP从UPR传感器(PERK、IRE1α、ATF6)上解离，从而抑制了UPR的激活。这种抑制作用导致错误折叠蛋白在内质网中积聚，破坏蛋白质稳态，引起内质网碎片化。

研究进一步发现，内质网稳态的破坏引发了细胞内钙稳态失衡。circATF6过表达导致内质网中的钙离子释放到细胞质中，引起钙超载，最终触发DTP细胞凋亡。值得注意的是，这种效应具有状态选择性，仅在DTP细胞中发挥作用，而对亲代细胞和获得性耐药细胞影响较小。

在转化应用方面，研究人员开发了脂质纳米颗粒(LNP)包裹的circATF6治疗策略。动物实验表明，circATF6-LNP与Osi联用能够显著抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存期，且未观察到明显系统性毒性。这一发现为克服EGFR-TKI耐药提供了新型RNA治疗策略，具有重要的临床转化价值。

研究采用的关键技术方法包括：RNA测序技术筛选差异表达circRNA；体内条形码文库筛选鉴定功能性circRNA；RNA pulldown、RIP、CLIP等技术验证circATF6与BiP的相互作用；表面等离子共振(SPR)分析结合亲和力；细胞钙成像技术监测钙动力学；患者来源移植瘤(PDX)模型验证临床相关性；LNP包裹circRNA的体内递送系统评估治疗效果。

circATF6在DTP细胞中通过ADAR1调控发生特异性下调

研究人员首先在EGFR突变NSCLC细胞系(HCC827和PC9)中建立了DTP细胞模型，证实DTP细胞具有可逆性、休眠性等特征。全转录组测序发现416个差异表达circRNA，其中circATF6在DTP细胞中显著下调。进一步实验证实，这种下调是由RNA编辑酶ADAR1介导的剪接调控所致。临床样本分析显示，在EGFR-TKI治疗的肺腺癌患者中，ATF6在DTP状态下上调，与细胞实验结果一致。

circATF6通过破坏蛋白质稳态选择性清除DTP细胞

功能实验表明，circATF6过表达能够显著增强Osi对DTP细胞的杀伤作用，诱导细胞凋亡，而这种效应在亲代细胞和获得性耐药细胞中不明显。机制上，RNA测序分析发现，circATF6过表达影响了内质网应激、UPR和钙离子稳态相关通路。进一步实验证实，circATF6过表达抑制了DTP细胞中激活的UPR信号，同时增强了内质网相关降解(ERAD)和内质网自噬(ER-phagy)活性，导致错误折叠蛋白积聚。

circATF6与BiP相互作用抑制UPR激活

为阐明分子机制，研究人员通过RNA pulldown联合质谱分析发现BiP是circATF6的结合蛋白。系列实验验证了circATF6与BiP的直接相互作用，并确定结合位点为BiP的ATP酶结构域(氨基酸125-280)。这种结合抑制了BiP的ATP酶活性，阻碍了BiP从UPR传感器上的解离，从而抑制了UPR通路的激活。

circATF6诱导钙超载触发DTP细胞凋亡

基于内质网是细胞内主要钙库的认知，研究人员进一步探讨了circATF6对钙稳态的影响。钙成像实验显示，circATF6过表达导致DTP细胞胞质钙水平显著升高，而内质网钙储存减少。使用钙螯合剂BAPTA-AM能够逆转circATF6诱导的细胞凋亡，证实钙超载是凋亡的关键机制。动物实验也表明，钙离子阻断剂维拉帕米能够逆转circATF6的抗肿瘤效果。

LNP递送circATF6增强EGFR-TKI疗效

最后，研究人员开发了LNP包裹的circATF6治疗策略。体外实验显示，circATF6-LNP与Osi联用能够显著抑制肿瘤细胞增殖，且这种协同效应可被钙螯合剂消除。在皮下移植瘤和原位肺肿瘤模型中，circATF6-LNP联合Osi治疗显著抑制了肿瘤生长，延长了小鼠生存期，且未引起系统性毒性反应。

本研究系统阐明了circATF6在调控DTP细胞命运中的关键作用及分子机制，提出了通过靶向蛋白质稳态和钙稳态清除DTP细胞的新策略。研究发现不仅深化了对DTP细胞生物学特性的认识，还为克服靶向药物耐药提供了有前景的治疗方案。circRNA-LNP联合EGFR-TKI的治疗策略具有临床转化潜力，有望为NSCLC患者提供新的治疗选择。