白细胞介素-1/Toll样受体信号通过调控巨噬细胞嗅觉受体OR6A2内吞加剧动脉粥样硬化的新机制

《Cell Reports》：Interleukin-1/Toll-like receptor signaling potentiates macrophage olfactory receptor 2-driven atherosclerosis

本研究针对动脉粥样硬化中炎症驱动机制不明的难题，揭示了IL-1R1/TLR信号通过促进TRAF6CCD与β-抑制蛋白2（βarr2）结合，竞争性抑制OR6A2与βarr2的结合，从而阻断OR6A2的内吞过程，最终增强NLRP3炎症小体活化。该发现阐明了炎症信号与GPCR trafficking交叉调控的新范式，为靶向干预血管炎症提供了新策略。

　　

在动脉粥样硬化的复杂病理过程中，炎症反应扮演着核心角色。尤其是巨噬细胞中的NLRP3炎症小体活化，被认为是推动疾病进展的关键环节。近年来，科学家们发现，除了传统的病原相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP）外，一些意想不到的受体，例如嗅觉受体（Olfactory Receptors, ORs），竟然也在巨噬细胞中表达并参与炎症调控。其中，嗅觉受体6A2（OR6A2，小鼠中为Olfr2）及其配体辛醛（octanal）被证实能激活NLRP3炎症小体，促进动脉粥样硬化。辛醛是氧化低密度脂蛋白（oxLDL）的衍生物，在动脉粥样硬化患者和小鼠模型中水平升高。然而，一个关键的科学问题悬而未决：已知的强效促炎信号通路，如白细胞介素-1受体（IL-1R1）和Toll样受体（TLR）信号，是如何影响OR6A2这一“非典型”炎症激活途径的？两者之间是否存在协同作用，从而共同加剧血管炎症？这成为了本研究试图解开的核心谜团。

为了深入探索这一问题，发表在《Cell Reports》上的这项研究综合运用了多种关键技术方法。研究团队利用基因工程手段构建了多种基因敲入小鼠模型（包括Or6a2^ICL3mut、βarr2^F116A、Traf6^ΔCCD和βarr2^K295R），并在载脂蛋白E缺陷（Ldlr^-/-）小鼠中进行了骨髓移植（BMT）和高胆固醇饮食（HCD）诱导的动脉粥样硬化模型。在细胞水平，研究人员采用了人单核细胞来源的巨噬细胞（hMDMφ）和小鼠骨髓来源的巨噬细胞（mBMDMφ）进行体外实验。关键的相互作用研究依赖于分裂荧光素酶（split-Luc）结合实验、免疫共沉淀（Co-IP）和蛋白质印迹（Western Blot）技术，以精确量化蛋白质间的结合情况。此外，细胞表面酶联免疫吸附试验（cs-ELISA）、流式细胞术（FACS）和实时荧光共振能量转移（TR-FRET）内吞实验被用于评估OR6A2在细胞膜表面的表达和内化过程。炎症反应的指标则通过cAMP检测、 caspase-1活性测定以及白细胞介素-1α/β（IL-1α/β）的释放来评估。研究还纳入了人颈动脉内膜切除术（CEA）获得的斑块样本进行相关分析。

βarr2介导OR6A2内吞，抑制巨噬细胞炎症小体活化

研究首先证实了β-抑制蛋白2（βarr2）在OR6A2信号调控中的关键作用。利用分裂荧光素酶系统，研究人员发现辛醛或oxLDL能够剂量依赖性地促进OR6A2与βarr2的结合，而OR6A2的抑制剂香茅醛（citral）则可抑制这一结合。进一步机制探索表明，OR6A2第三个胞内环（OR6A2^ICL3）上的丝氨酸/苏氨酸 motif 和βarr2的 arrestin-related trafficking（ART） motif 对于GRK激酶依赖性的OR6A2-βarr2结合以及后续的βarr2/AP2介导的clathrin依赖的内吞过程至关重要。当通过基因突变（OR6A2^ICL3mut或βarr2^F116A）破坏OR6A2-βarr2结合后，OR6A2在巨噬细胞膜表面的表达增加，导致其对辛醛刺激的反应增强，表现为cAMP水平升高以及caspase-1活化和IL-1α/β分泌加剧。在动物实验中，移植了Or6a2^ICL3mut或βarr2^F116A骨髓的Ldlr^-/-小鼠，在高胆固醇饮食喂养后，其动脉粥样硬化斑块面积、坏死核心区域显著增大，胶原含量减少，而使用OR6A2抑制剂香茅醛可以逆转这些效应。这表明，破坏βarr2介导的OR6A2内吞会增强OR6A2驱动的动脉粥样硬化。

IL-1R1和TLR2/4信号通过转录及转录后机制促进巨噬细胞OR6A2膜表面表达

接下来，研究探讨了IL-1R1/TLR信号如何调控OR6A2。对颈动脉斑块样本的分析显示，斑块中IL-1α/β的释放量与巨噬细胞富集区的OR6A2 mRNA水平呈正相关。体外实验表明，IL-1β和TLR4配体LPS等能够上调巨噬细胞中OR6A2的mRNA和蛋白表达。值得注意的是，在辛醛存在的情况下，IL-1R1/TLR2/4的激活会引起OR6A2膜表面蛋白表达的上调程度远超过其mRNA的上调，提示存在转录后调控机制。在转录层面，IL-1R1/TLR信号通过激活p38 MAPK，促进其下游转录因子C/EBPβ与OR6A2启动子区的结合，从而增强OR6A2的转录。此外，辛醛本身也能通过上调IL-1α/β分泌，形成一个IL-1R依赖的正反馈环路，持续驱动OR6A2的转录激活。

IL-1R1/TLR信号介质TRAF6促进巨噬细胞OR6A2膜表面表达及辛醛诱导的炎症小体反应

为了探究转录后调控的机制，研究人员将目光投向了IL-1R1/TLR信号通路的关键衔接蛋白TRAF6。研究发现，在巨噬细胞中，IL-1R1/TLR信号的激活并不导致OR6A2与IL-1R1或TLR2/4形成直接的物理相互作用（异源二聚化）。然而，利用小干扰RNA（siRNA）敲低MyD88、IRAK1或TRAF6等信号分子后，LPS诱导的OR6A2膜表面表达上调以及辛醛引发的cAMP和炎症小体反应均被显著抑制，其中TRAF6的敲低效应最为明显。Traf6基因敲除的巨噬细胞也证实了TRAF6对于IL-1R1/TLR信号增强OR6A2功能是必需的。

IL-1R1/TLR激活的TRAF6^CCD-βarr2耦合抑制βarr2/AP2介导的OR6A2内吞，增强炎症小体活化

那么，TRAF6究竟是如何在转录后水平影响OR6A2的呢？此前的研究已知，βarr2的C端结构域（βarr2^CD）既能与内吞相关蛋白AP2B1结合，也能与TRAF6的卷曲螺旋结构域（TRAF6^CCD）结合。本研究提出了一个精巧的“竞争性转换”模型：在静息状态下，βarr2倾向于与AP2B1结合，从而介导OR6A2的内吞，抑制其信号。而当IL-1R1/TLR信号激活时，会促使βarr2^CD与TRAF6^CCD结合，这便竞争性地减少了βarr2与AP2B1的结合，进而抑制了OR6A2的内吞，使得更多的OR6A2滞留于细胞膜上，持续接收辛醛信号，放大炎症反应。分裂荧光素酶实验和免疫共沉淀结果完美验证了这一模型：IL-1β、LPS或PGN的刺激显著增强了TRAF6-βarr2的结合，同时削弱了AP2B1-βarr2以及OR6A2-βarr2的结合，并减少了OR6A2的内吞。在功能上，表达TRAF6^ΔCCD（缺失CCD结构域）的巨噬细胞，其OR6A2膜表面表达和辛醛诱导的炎症反应均显著降低。在动物层面，移植了Traf6^ΔCCD骨髓的Ldlr^-/-小鼠，在辛醛刺激下，其动脉粥样硬化病变程度明显轻于对照组。

IL-1R1/TLR激活的βarr2^K295去SUMO化驱动巨噬细胞中TRAF6^CCD-βarr2耦合

研究进一步深入挖掘了调控这一“竞争性转换”的上游分子开关。他们发现，βarr2第295位赖氨酸（βarr2^K295）的SUMO化修饰是关键。SUMO化会破坏βarr2与TRAF6的结合。本研究发现，IL-1R1/TLR信号能够上调去SUMO化酶SENP1的表达，同时下调SUMO化酶复合物SUMO1/UBC9的水平，从而创造一个有利于βarr2去SUMO化的细胞内环境。实验证明，过表达SENP1能够增强TLR4激活下的TRAF6-βarr2结合，并减少AP2B1-βarr2和OR6A2-βarr2结合；而过表达SUMO1/UBC9则产生相反效果。更重要的是，构建了非SUMO化形式的βarr2^K295R（赖氨酸突变为精氨酸）突变体后，即使在没有IL-1R1/TLR刺激的情况下，巨噬细胞也表现出OR6A2膜表面表达升高和辛醛诱导的炎症反应增强。在动脉粥样硬化模型中，移植了βarr2^K295R骨髓的Ldlr^-/-小鼠显示出更严重的病变，且该效应可被OR6A2抑制剂香茅醛所逆转。这表明，βarr2^K295的去SUMO化是驱动TRAF6^CCD-βarr2耦合、进而促进OR6A2介导的动脉粥样硬化的核心分子事件。

综上所述，本研究揭示了一条全新的炎症放大通路：在动脉粥样硬化斑块微环境中，oxLDL衍生的辛醛“启动”了巨噬细胞膜上的OR6A2受体，而同时存在的IL-1R1/TLR配体（如IL-1β、LPS等）则通过诱导βarr2^K295去SUMO化，促使βarr2与TRAF6^CCD结合，从而将βarr2“劫持”离开其原本的内吞职责。这导致OR6A2无法被有效内吞和降解，使其在细胞膜上“超长待机”，持续激活NLRP3炎症小体，最终加剧动脉粥样硬化进程。

这项研究的重大意义在于，它首次阐明了固有免疫信号（IL-1R/TLR）如何通过调控GPCR（OR6A2）的内吞 trafficking 来精确放大炎症反应，这为理解慢性炎症性疾病中不同信号通路的交叉对话提供了崭新视角。所发现的TRAF6^CCD-βarr2相互作用界面以及βarr2^K295SUMO化修饰，有望成为未来治疗动脉粥样硬化等炎症驱动性血管疾病的新靶点。例如，开发能够特异性阻断TRAF6^CCD-βarr2耦合的小分子或多肽，或者利用靶向递送技术干预斑块内巨噬细胞的SUMO化平衡，可能成为极具潜力的治疗策略。该研究不仅深化了对动脉粥样硬化发病机制的认识，也为开发抗炎性血管疾病疗法开辟了新的道路。