Jub诱导Warts磷酸化通过抑制其相分离凝聚体招募调控Hippo信号通路的机制研究

《Cell Reports》：Jub-induced phosphorylation of Warts inhibits its activity and recruitment into biomolecular condensates

本研究针对Hippo信号通路核心激酶Warts（Wts）如何在抑制性（Jub）和激活型（Ex/Kibra）生物分子凝聚体之间进行特异性分配的调控难题，发现Jub不仅形成抑制性凝聚体招募Wts，还通过Mnb/Hipk激酶介导Wts N端无序区（IDR）的磷酸化修饰。该磷酸化通过降低Wts与激活型凝聚体的结合能力而抑制其活性，揭示了相分离调控中翻译后修饰的新机制，为理解细胞生长调控和肿瘤发生提供了新视角。

　　

在细胞生物学研究领域，生物分子凝聚体通过液-液相分离（LLPS）调控细胞信号转导已成为前沿热点。作为调控组织生长和细胞命运的关键通路，Hippo信号通路的核心激酶Warts（Wts）及其哺乳动物同源物LATS的活性调控机制备受关注。虽然已知上游支架蛋白如Expanded（Ex）和Kibra可通过形成相分离凝聚体激活Wts，但抑制性信号如何精确调控Wts的凝聚体分配仍不清楚，特别是黏附连接处的张力传感器Ajuba（Jub）如何抑制Wts活性的机制存在知识空白。

为了解决这一难题，研究人员在《Cell Reports》上发表了最新研究成果。他们发现Jub本身也能形成相分离凝聚体并招募Wts，这引发了Wts如何在抑制性和激活型凝聚体之间进行分配调控的思考。通过系统研究，团队揭示了Jub促进Wts N端无序区磷酸化的新机制，并证明这种磷酸化修饰能够调控Wts与不同凝聚体的结合偏好，从而影响其活性。

研究主要采用了分子生物学技术（包括质粒构建、点突变）、细胞生物学技术（免疫荧光、FRAP分析）、生物化学方法（免疫共沉淀、磷酸化检测）以及果蝇遗传学模型。通过体外培养的果蝇S2细胞系和果蝇翅膀 discs 组织样本，研究人员结合活细胞成像、蛋白质相互作用分析和功能验证实验，系统阐明了调控机制。

Jub形成相分离凝聚体

研究人员首先证实Jub在S2细胞中能形成典型的液-液相分离凝聚体，表现为球形结构、快速融合特性以及荧光恢复后光漂白（FRAP）实验中的快速荧光恢复。在果蝇翅膀 discs 中，Jub凝聚体位于黏附连接处，且荧光恢复速度较慢，可能与Jub与连接处蛋白的相互作用有关。有趣的是，不同的标签影响Jub凝聚体的形态：带电荷的FLAG标签使Jub形成空心球壳结构，而Venus或mNeonGreen标签则形成实心球体。

Jub招募Wts进入凝聚体

在共表达实验中，Jub能有效招募Wts进入其形成的凝聚体。结构-功能分析显示，Jub的LIM1和LIM2结构域对于招募Wts进入凝聚体至关重要，这与Jub在体内调控Wts活性的功能需求一致。当Wts被招募到Jub凝聚体时，它倾向于分布在凝聚体的边缘界面区域，表明Wts与Jub凝聚体的相互作用存在特异性分配。

Wts激活剂也能招募Wts进入凝聚体

与抑制性凝聚体相对应，研究人员发现Wts激活剂Kibra和Ex也能形成相分离凝聚体并招募Wts。当Kibra与Wts共表达时，Wts主要分布在Kibra凝聚体边缘；而Ex与Wts的共定位程度较低，但在Hpo存在时有所增强。当Jub、Wts和Kibra/Ex三者共表达时，Wts可同时分布在Jub和Kibra/Ex形成的不同凝聚体中，表明Wts在不同凝聚体间的分配可能存在动态平衡。

Jub诱导Wts N端磷酸化

机制探索中发现，Jub表达会引起Wts蛋白电泳迁移率下降，磷酸酶处理证实这是磷酸化修饰所致。通过片段映射，研究人员将磷酸化位点定位于Wts N端前404个氨基酸的无序区域。质谱分析鉴定了12个Jub依赖的磷酸化位点，均为Ser/Thr-Pro模式，提示参与激酶为脯氨酸导向的Ser/Thr激酶。最终，通过点突变实验确认15个潜在磷酸化位点的突变（15NP）可完全消除Jub引起的迁移率变化。

Wts N端磷酸化位点调控体内Wts活性

功能研究表明，在果蝇翅膀中过表达磷酸化位点突变为不可磷酸化形式（15NP）的Wts会导致翅膀更小，Wts活性增强；而磷酸模拟突变（15PM）则使翅膀较大，Wts活性减弱。通过检测Hippo通路报告基因ex-lacZ的表达，进一步证实了磷酸化状态对Wts活性的调控作用，且这种调控具有表达水平依赖性。

Wts N端磷酸化位点调控凝聚体招募

细胞和体内实验均显示，磷酸化状态影响Wts与激活型凝聚体的结合：Wts^15NP与Kibra和Ex凝聚体的共定位增强，而Wts^15PM的共定位减弱。这种效应在酸性蛋白Kibra（可能涉及电荷相互作用）和Ex中均存在，但对Jub凝聚体的招募影响不显著，可能与Jub的等电点较为中性有关。

Mnb和Hipk介导Jub依赖的Wts磷酸化

通过RNAi筛选，研究人员发现Minibrain（Mnb）和Homeodomain-interacting protein kinase（Hipk）是介导Jub依赖的Wts磷酸化的关键激酶。同时敲低mnb和Hipk能显著减少Wts磷酸化，而过表达这些激酶或使用抑制剂Abemaciclib处理均能调控磷酸化水平。在体内，Mnb和Hipk与Jub共定位于黏附连接处，且它们的定位依赖于Jub并受细胞张力调控。

Mnb和Hipk对Wts的影响

遗传学分析显示，mnb和Hipk的敲低能增强Wts与Kibra凝聚体的共定位，而这种效应在Wts^15PM中消失，证明Mnb/Hipk通过磷酸化Wts N端来调控其凝聚体分配。这些激酶可能通过多种机制影响Hippo信号，包括直接磷酸化Yki，但本研究明确了它们在Jub-Wts调控轴中的核心作用。

研究结论表明，Jub通过双重机制抑制Wts活性：一是通过形成抑制性凝聚体隔离Wts；二是通过招募Mnb/Hipk激酶促进Wts N端磷酸化，减少Wts与激活型复合物的结合。这种磷酸化调控机制即使在Wts脱离Jub凝聚体后仍可维持抑制作用，确保了信号调控的持续性。该研究不仅揭示了相分离调控中翻译后修饰的重要作用，还为理解HIPK/DYRK激酶在癌症中的作用提供了新思路，因为Hippo信号通路失调与多种肿瘤密切相关。

值得注意的是，哺乳动物LATS激酶的N端同样含有多个SP/TP位点，且部分位于相分离关键区域，提示类似调控机制可能在不同物种中保守存在。未来研究将进一步探索内源性Wts磷酸化检测、特定磷酸化位点的功能权重以及磷酸化影响相分离的物理化学机制。