基于网络分析揭示miRNA调控2型糖尿病β细胞胰岛素分泌的分子机制

《iScience》：Network-based insights into miRNA regulation of β-cell insulin secretion in type 2 diabetes

本研究针对2型糖尿病(T2D)中β细胞胰岛素分泌功能障碍的机制问题，通过小RNA测序分析人胰岛中miRNA表达谱，发现70个差异表达miRNA，其中8个与双相胰岛素分泌相关。研究证实miR-101-3p通过靶向CADM1调控胰岛素分泌，揭示了miRNA网络在T2D发病机制中的补偿作用，为糖尿病治疗提供了新靶点。

　　

随着全球糖尿病患病率的持续攀升，2型糖尿病(T2D)已成为严峻的公共卫生挑战。预计到2050年，全球糖尿病患者将达到8.53亿人。这种代谢性疾病的核心特征包括胰腺β细胞胰岛素分泌功能障碍和外周胰岛素抵抗。在疾病发展过程中，β细胞会通过代偿机制应对胰岛素需求增加，但最终导致功能衰竭。深入理解β细胞胰岛素分泌的分子调控机制，特别是其在高血糖状态下功能失调的原因，对于开发更有效的治疗方法至关重要。

近年来，越来越多的证据表明微小RNA(microRNA, miRNA)在T2D发病过程中的β细胞代偿机制中发挥着重要作用。这些长度约22个核苷酸的非编码RNA通过结合靶信使RNA(mRNA)的3'非翻译区(3'UTR)，在转录后水平精细调控基因表达。在胰腺胰岛和β细胞中最早发现的miRNA包括miR-375和miR-9，它们被证实参与调控胰岛素分泌的关键过程。然而，现有研究多集中于单个miRNA的功能分析，未能全面揭示miRNA-mRNA相互作用网络的复杂性。

为了系统阐明T2D中miRNA表达变化与胰岛素分泌的关联，Lena Eliasson团队在《iScience》上发表了最新研究成果。研究人员收集了61例人胰岛样本(9例T2D患者和52例非糖尿病患者)，通过小RNA测序(sRNA-seq)技术全面分析miRNA表达谱，并结合动态葡萄糖灌注实验评估胰岛素分泌功能。研究整合了生物信息学分析和体外功能验证，构建了T2D相关的miRNA-mRNA调控网络。

研究的关键技术方法包括：人胰岛样本的小RNA测序和差异表达分析、动态葡萄糖刺激胰岛素分泌测定、miRNA-mRNA靶标关系预测与验证、加权基因共表达网络分析(WGCNA)、以及体外细胞模型(INS-1 832/13和EndoC-βH1细胞)的功能验证实验。

差异表达miRNA在T2D中的鉴定及其与胰岛素分泌的关联

研究人员首先通过动态葡萄糖灌注实验评估了人胰岛的胰岛素分泌功能。结果显示，与非糖尿病(ND)个体相比，T2D捐赠者胰岛的第一相和第二相胰岛素分泌均显著降低。通过关联分析，发现41个miRNA与第一相胰岛素分泌相关，53个与第二相胰岛素分泌相关，其中16个为两者共有。

差异表达分析共鉴定出70个在T2D胰岛中差异表达的miRNA(34个上调，36个下调)。特别值得注意的是，其中8个差异表达miRNA与双相胰岛素分泌均相关，包括miR-101-3p和miR-9-5p。疾病富集分析进一步证实，上调的miRNA在T2D相关数据库中显著富集，提示它们可能在该疾病中发挥重要作用。

跨研究比较发现，miR-187-3p是唯一在五个独立研究中一致报道在T2D中上调的miRNA。体外功能实验显示，过表达miR-187-3p虽不影响葡萄糖刺激的胰岛素分泌，但降低了胰岛素含量。此外，研究还发现113个miRNA的表达与HbA1c水平相关，55个与BMI相关，5个存在性别差异表达。

T2D中调控网络富集了DE miRNA的mRNA靶标

通过整合分析，研究团队确定了4,951个与70个差异表达miRNA负相关的mRNA靶标。上调miRNA的靶标数量(3,159个)几乎是下调miRNA靶标数量(1,800个)的两倍。miR-101-3p拥有最多的靶标(766个mRNA)，而高度表达的胰岛基因(如INS和GCG)则被较少miRNA靶向。

有趣的是，研究人员发现miRNA生物合成的关键调控因子DICER1被至少15个上调miRNA靶向，表明其表达可能受到miRNA的精细调控。这一发现提示了miRNA与DICER1之间可能存在复杂的反馈调控环路。

共表达聚类揭示胰岛素分泌通路在上调miRNA靶标中的富集

通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)，研究人员将4,951个mRNA靶标划分为12个共表达簇。其中，簇6专门与上调miRNA相关联，而簇11则与下调miRNA相关。功能富集分析显示，簇6中的基因显著富集于"胰岛素分泌"、"突触组织"和"膜电位调控"等通路，这些通路在其他簇中未见富集。

这一发现进一步支持了上调miRNA在T2D特征描述中比下调miRNA发挥更重要作用的概念，因为它们特异性地靶向参与胰岛素分泌关键通路的基因。

miR-9-5p和miR-101-3p在胰岛素分泌细胞系中的功能验证

研究人员选择了两名最有前景的miRNA候选物进行功能验证：miR-9-5p和miR-101-3p。miR-9-5p是T2D中差异表达的miRNA，也是唯一与双相胰岛素分泌均相关的miRNA。miR-101-3p同样在T2D中差异表达，与第二相胰岛素分泌显著相关，与第一相分泌也呈现关联趋势。

在INS-1 832/13细胞中过表达miR-9-5p并未改变葡萄糖刺激的胰岛素分泌，但增加了细胞内胰岛素含量。相反，过表达miR-101-3p则增强了胰岛素分泌，同时降低了胰岛素含量。在人源EndoC-βH1细胞中的验证实验也得出了类似结果，进一步证实了miR-101-3p对胰岛素分泌的促进作用。

miR-101-3p在葡萄糖毒性和葡萄糖脂毒性条件下调控Cadm1表达

研究人员进一步探讨了miR-101-3p与其靶标基因的相互作用。在84个与双相胰岛素分泌相关的miR-101-3p靶标中，他们选择了8个在β细胞中富集的基因进行验证。结果显示，只有Cadm1的表达在过表达miR-101-3p的INS-1 832/13细胞中显著降低，且这一调控位点在人和大鼠之间高度保守。

Western blot分析进一步证实了CADM1蛋白水平的降低。在葡萄糖毒性(GT)和葡萄糖脂毒性(GLT)条件下，Cadm1表达下降，而miR-101-3p的表达未受影响。值得注意的是，在GT和GLT条件下过表达miR-101-3p会进一步降低Cadm1表达，并部分抵消由GT和GLT引起的胰岛素分泌减少。

研究结论与意义

这项研究通过系统分析T2D人胰岛中差异表达的miRNA、它们与胰岛素分泌的关联以及靶标mRNA的鉴定，全面揭示了miRNA介导的基因调控网络如何影响β细胞胰岛素分泌。研究发现，上调的miRNA在T2D特征描述中比下调miRNA发挥更重要的作用，它们靶向更多数量的mRNA，包括DICER1和CADM1等关键调控因子。

特别值得注意的是miR-101-3p，这是首次在人胰岛中描述该miRNA的功能。它拥有最多的mRNA靶标，与双相胰岛素分泌均相关，并在体外实验中显示出促进胰岛素分泌的作用。其靶标CADM1是一种生长抑制因子，已知能通过重塑肌动蛋白细胞骨架和与胞吐蛋白相互作用来增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌。研究表明，miR-101-3p的上调可能是T2D发病过程中增强胰岛素分泌的代偿机制的一部分。

研究还验证了miR-9-5p在T2D中的差异表达，并发现它与双相胰岛素分泌均有最强相关性。与先前在啮齿动物模型中的报道不同，本研究支持miR-9-5p在β细胞代偿调控中的作用。两个miRNA共同调控多个靶标，包括PDE7B、STARD13、ANK3和SYT13等与胰岛素分泌密切相关的基因。

这项研究的创新之处在于首次全面探讨了人胰岛miRNA表达变化与体内阶段性胰岛素分泌的关联，揭示了miRNA网络在T2D发病机制中的复杂调控作用。研究结果表明，特定的miRNA如miR-101-3p可能参与T2D发病过程中β细胞应激的代偿反应，为开发保护或增强β细胞功能的糖尿病治疗新策略提供了潜在靶点。

研究的局限性包括使用全胰岛而非纯化β细胞进行测序分析，以及依赖细胞系而非原代人类β细胞进行功能验证。然而，这些发现为理解miRNA在T2D病理生理中的作用提供了重要见解，并为未来研究指明了方向。进一步探索这些miRNA的具体机制，将有助于评估它们作为糖尿病治疗靶点的潜力。