综述：线粒体丙酮酸载体的结构、转运及抑制机制

《TRENDS IN Biochemical Sciences》：Structural transport and inhibition mechanism of the mitochondrial pyruvate carrier

本综述系统解析了线粒体丙酮酸载体（MPC）的原子结构突破，首次揭示了其跨膜取向、pH依赖的丙酮酸转运机制及多类抑制剂的结合模式。文章整合冷冻电镜（cryo-EM）与AlphaFold建模数据，阐明了MPC作为SLC54家族成员，通过交替开放机制将糖酵解终产物丙酮酸转运至线粒体基质，为治疗2型糖尿病（T2D）、代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）、神经退行性疾病及特定癌症的药物研发提供了关键结构基础。

　　

生理功能、生化特性与治疗机遇

真核细胞依赖高效的代谢途径通过氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation）产生ATP。线粒体丙酮酸载体（MPC）作为位于线粒体内膜（Mitochondrial Inner Membrane）的整合膜蛋白复合物，在此过程中扮演关键角色：它负责将胞浆糖酵解产生的丙酮酸（Pyruvate）转运至线粒体基质。丙酮酸还可来源于乳酸（Lactate）、苹果酸（Malate）及丙氨酸（Alanine）、丝氨酸（Serine）、半胱氨酸（Cysteine）等生糖氨基酸。进入基质后，丙酮酸经丙酮酸脱氢酶（Pyruvate Dehydrogenase）转化为乙酰辅酶A（Acetyl-CoA），进入三羧酸循环（TCA Cycle），使ATP产量较乳酸发酵提高约15倍。此外，丙酮酸也可经丙酮酸羧化酶（Pyruvate Carboxylase）转化为草酰乙酸（Oxaloacetate），为TCA循环提供回补反应（Anaplerotic Input）底物，或在糖异生（Gluconeogenesis）中通过苹果酸-天冬氨酸穿梭（Malate/Aspartate Shuttle）合成葡萄糖。TCA循环生成的柠檬酸（Citrate）可经柠檬酸载体（Citrate Carrier, CIC）输出至胞浆，启动新生脂质合成（De Novo Lipogenesis）。因此，MPC在胚胎发育等多种生理过程中至关重要，并已成为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH，原NASH）、特定癌症、脱发（Alopecia）及神经退行性疾病的潜在药理靶点。

螺旋拓扑结构与膜取向

早期研究基于半胱氨酸标记和有限蛋白酶解实验（Limited-proteolysis Experiments）曾提出酵母Mpc1含2个跨膜螺旋（Transmembrane Helices, TMs），Mpc2/Mpc3含3个TM，且N端位于基质、C端分别位于基质（Mpc1）和膜间隙（Mpc2）。然而，近期人源MPC1L/MPC2与MPC1/MPC2的冷冻电镜结构明确显示，每个原体（Protomer）均包含一个N端两亲性螺旋（Amphipathic Helix, AH）、一个短连接螺旋（Linker Helix, LH）及三个跨膜螺旋（H1, H2, H3）。连接H1与H2的短环含有一个3₁₀-螺旋，而H3延伸至基质侧。

关于膜取向，Sichrovsky等人通过流式细胞术（Flow Cytometry）抗体标记和蛋白酶K保护实验（Proteinase K Protection Assay）证实：在保留天然取向的线粒体（Mitoplasts）中，MPC1和MPC2的C端均受保护；而在内膜外翻的亚线粒体颗粒（Submitochondrial Particles, SMPs）中，C端可被蛋白酶降解。这表明两个原体的N端两亲性螺旋位于膜间隙（Intermembrane Space, IMS），而C端均位于基质（Matrix）。此取向与TIM22介导的插入机制一致，且更合理：带负电的抑制剂（如UK5099）无需克服线粒体膜电位（Membrane Potential）跨内膜扩散，仅需通过外膜电压依赖性阴离子通道（Voltage-Dependent Anion Channels）即可结合MPC。

冷冻电镜与AlphaFold解析的结构

MPC结构解析的延迟源于其分子量小（~40 kDa）、疏水性强及伪二重对称性（Pseudo-twofold Symmetry）对冷冻电镜技术的挑战。多个研究组通过使用fiducial markers（如legobodies、nanobodies、pro-macrobodies）或构建融合蛋白（Fusion Proteins）增大颗粒尺寸，成功解析了人源MPC1/MPC2与MPC1L/MPC2在外向开放（Outward-open）、闭塞（Occluded）及内向开放（Inward-open）状态的结构，分辨率范围在3.0–3.7 ?。

结构证实MPC为异源二聚体（Heterodimer），属于转运蛋白-视蛋白-G蛋白偶联受体（Transporter-opsin-G-Protein-coupled Receptor, TOG）超家族。每个原体的三个跨膜螺旋围绕一个伪二重对称轴排列，形成桶状结构，中心为水填充的空腔。N端和连接螺旋为两亲性，柔性较大，位于内膜外叶。MPC2的两亲性螺旋形成螺旋-转角-螺旋（Helix-turn-helix） motif，破坏了整体对称性。

构象机制与底物配位

MPC通过交替开放机制（Alternating Access Mechanism）转运丙酮酸：从外向开放状态（底物结合位点朝向膜间隙）经闭塞状态（位点两侧不可及）转变为内向开放状态（位点朝向基质）。

He等人和Sun等人分别报道了MPC1/MPC2在丙酮酸存在下的内向开放状态结构，但底物密度较弱，可能捕获了丙酮酸释放至基质的瞬间。Liang等人报道的闭塞状态结构中，未明确观察到丙酮酸结合。Sichrovsky等人利用AlphaFold Multimer生成了覆盖全部构象状态的模型，并通过诱导契合对接（Induced-fit Docking）预测了闭塞状态下的丙酮酸结合模式：丙酮酸与MPC1L的H86、MPC2的K49和N100形成关键相互作用。突变验证显示，H86（MPC1L）和K49（MPC2）对丙酮酸结合至关重要。

丙酮酸转运依赖跨内膜pH梯度（ΔpH）而非膜电位，表明为电中性（Electroneutral）机制。热稳定性位移实验（Thermostability Shift Assays）显示丙酮酸结合具有pH依赖性：在pH<6时结合强，pH>6时结合弱，转折点约在pH 6，可能与H86（pK_a~6）的质子化状态相关。在低pH下，质子化的H86与K49通过离子相互作用结合丙酮酸，Y64和N100提供额外氢键；而在高pH下，中性H86与Y64形成氢键，促使底物释放。

ΔpH依赖的丙酮酸转运循环模型

基于上述机制，提出以下ΔpH依赖的交替访问模型（图4）：

1. 1.
   外向开放状态：结合位点暴露于膜间隙局部微环境（pH可能<6）。丙酮酸进入中心空腔，其羧基与带正电的K49相互作用，促进H86质子化。
2. 2.
   底物结合触发构象变化：丙酮酸结合使K49与H84/H86靠近，降低能垒，过渡至丙酮酸结合的闭塞状态。
3. 3.
   构象变化暴露于高pH环境：结合位点转向基质侧（pH高），H84/H86去质子化，丙酮酸结合模式重组并释放。
4. 4.
   转运体重置：内向开放apo状态经apo闭塞状态返回外向开放状态，完成循环。
   外向开放状态因亚基间接触更多而能量较低，为优势构象；底子和质子结合降低能垒，使内向开放状态可达。外向开放状态空腔狭窄，利于静电吸引丙酮酸；内向开放状态空腔扩大，加速底物释放。

抑制剂结合的结构基础

MPC是治疗代谢疾病的重要靶点，其结构与多种抑制剂复合物已被解析：

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  UK5099及其衍生物C7：氰基丙烯酸基团（Cyano-acrylate Group）深入结合空腔底部，羧基与H84（MPC1）和K49（MPC2）形成盐桥，N33、Y62（MPC1）及N100（MPC2）提供氢键。苯基吲哚基团可旋转，与Y85（MPC2）或F71（MPC1）发生π-π堆积。C7的呋喃环与F71（MPC1L）和W82（MPC2）堆叠，硝基可能与N79（MPC1L）相互作用，解释其高亲和力（IC₅₀~5 nM）。
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  噻唑烷二酮类（Thiazolidinediones, TZDs）：如米托格列酮（Mitoglitazone, MTG）和GW604714X，TZD环通过氢键与Y64、H86（MPC1L）、K49和N100（MPC2）相互作用。米托格列酮C5为手性中心，易外消旋化；GW604714X的C5为sp²杂化，双键可呈E/Z构型，Z构型能最大化蛋白-抑制剂相互作用。
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  扎普司特（Zaprinast）：杂环指向空腔底部，与Y64、H86（MPC1L）、K49和N100（MPC2）形成氢键。

尽管化学结构迥异，所有抑制剂均结合于外向开放状态的同一空腔：其极性基团（如氰基丙烯酸、TZD环、三唑并嘧啶酮环）模拟丙酮酸的羧基和羰基，与K49和H84/H86相互作用；中心芳香基团则与MPC的芳香残基发生疏水堆积。突变和结合实验验证了K49、H86、W82等残基对抑制剂结合的关键作用。

结语与展望

人源MPC结构的多状态解析是理解其转运与抑制机制的重大突破，揭示了ΔpH驱动的丙酮酸转运原理及多类抑制剂通过模拟底物相互作用“锁死”外向开放状态的共同策略。这些发现为针对癌症、2型糖尿病、MASH及神经退行性疾病的基于结构的药物设计（Structure-based Drug Design）奠定了分子基础。未来研究仍需探索MPC的进化起源、构象变化触发机制、潜在反向底物（Counter-substrate）、质子耦合细节及其他抑制剂类的结合模式，以全面揭示这一关键转运体的生物学功能与治疗潜力。