《Biochemical Pharmacology》：Targeting the DYNLL2-PAK1 axis inhibits caspase-11-dependent pyroptosis to alleviate sepsis
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本研究通过生物信息学与机器学习分析临床数据，发现DYNLL2基因在脓毒症进展中起关键作用，其与PAK1相互作用调控革兰氏阴性菌外膜小泡（OMV）内吞，释放LPS激活Caspase-11炎症小体，引发炎症反应。通过虚拟筛选鉴定Oroxylin A为潜在抑制剂，在小鼠内毒素血症模型中验证其改善生存、减轻多器官损伤及抑制系统性炎症的效果。该研究揭示了DYNLL2-PAK1轴在脓毒症病理机制中的核心作用，并提出Oroxylin A作为治疗候选药物。
陈周|卢家晨|张欣宇|赵家伟|刘一曼|白东升|赵月
中国药科大学基础医学与临床药学院生理学系，天然药物国家重点实验室，江苏省癌症发生与干预重点实验室，南京市通家巷24号，210009，中国
摘要
败血症是一种由宿主对感染的异常反应引起的危及生命的综合征，由于其复杂的免疫病理生理学机制，目前缺乏有效的治疗策略。通过生物信息学和机器学习分析临床数据集，我们发现Dynein Light Chain LC8-Type 2（DYNLL2）是一个驱动败血症进展的关键风险基因。在败血症患者中，DYNLL2表达升高与预后不良和单核细胞扩增相关。机制上，DYNLL2与p21-激活激酶1（PAK1）相互作用，调节革兰氏阴性菌外膜囊泡（OMV）的内吞作用，促进细胞质脂多糖（LPS）的释放以及随后的Caspase-11炎性小体激活，从而引发细胞焦亡。敲低DYNLL2或PAK1可以抑制OMV的内吞、Caspase-11/Gasdermin D（GSDMD）的切割以及促炎细胞因子的释放，而不影响细菌的清除。虚拟筛选发现黄酮类化合物Oroxylin A是DYNLL2-PAK1相互作用的强效抑制剂。体外实验表明，Oroxylin A通过降低细胞质中的LPS水平来阻断Caspase-11依赖的细胞焦亡。在小鼠内毒素血症模型中，Oroxylin A能够改善生存状况，减轻多器官损伤，并抑制全身炎症。我们的发现揭示了DYNLL2-PAK1轴在败血症发病机制中的关键作用，并提出Oroxylin A作为潜在的治疗候选药物，以干扰细胞焦亡并恢复败血症患者的免疫稳态。
引言
败血症是一种由病原体感染引发的危及生命的疾病，其特征是过度的炎症反应和宿主免疫功能紊乱[1]，[2]。其核心病理特征是由于免疫反应失衡导致的致命器官功能障碍，具有显著的临床异质性和动态进展[3]，[4]，[5]。早期的高炎症状态常常与后期的免疫抑制并存，形成了一个复杂的调控网络[6]，[7]，[8]。在这些过程中，过度的炎症是疾病进展的关键驱动因素[9]，因此控制炎症成为治疗策略的核心。
败血症中的炎症病理放大与炎性小体的过度激活密切相关[10]，[11]，[12]。特别是Caspase-11炎性小体会诱导Gasdermin D（GSDMD）的切割和膜孔形成，引发细胞焦亡并导致高死亡率[13]，[14]。Caspase-11的激活需要细胞质中检测到脂多糖（LPS），这是革兰氏阴性菌膜的关键成分[15]，[16]。最新证据表明，外膜囊泡（OMV）负责将LPS输送到细胞质中，这意味着调节OMV的内吞作用可能是一种限制细胞质LPS暴露和随后炎性小体激活的新治疗方法[17]，[18]。
自噬是一种保守的稳态机制，在败血症发病机制中具有双重调节作用[19]，[20]，[21]，[22]。有益的是，它通过线粒体自噬维持线粒体质量控制，防止线粒体脱氧核糖核酸（mtDNA）泄漏和下游炎症信号传导[21]。同时，它还调节T细胞的代谢重编程，以保持免疫平衡[23]。系统研究自噬相关的分子事件可能揭示“免疫失调-器官衰竭”恶性循环的机制，并确定用于免疫重建和炎症缓解的阶段特异性治疗靶点[24]，[25]。
利用机器学习作为分析复杂生物系统的变革性工具，本研究结合生物信息学和自适应算法，确定Dynein Light Chain LC8-Type 2（DYNLL2）是败血症进展的关键调节因子。机制上，DYNLL2与p21-激活激酶1（PAK1）相互作用，调节OMV的内吞和Caspase-11的激活。通过针对DYNLL2-PAK1接口的虚拟筛选，我们发现了Oroxylin A这种潜在抑制剂，它可以阻断Caspase-11的激活和细胞质LPS的释放。体内验证证明了Oroxylin A在缓解LPS诱导的败血症方面的有效性。这些发现不仅阐明了DYNLL2在OMV转运中的调节作用，还提出了Oroxylin A作为有前景的治疗候选药物，推动了败血症机制的理解和药物开发。
部分内容片段
细胞培养
小鼠巨噬细胞J774A.1在RPMI 1640（Gibco，纽约，美国）中培养；HEK293T在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM（Gibco，纽约，美国）中培养。骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）从C57BL/6 wt和Caspase-11-/-小鼠中分离出来，然后用添加了10%（v/v）胎牛血清（Gibco，纽约，美国）和20 ng/ml GM-CSF（PeproTech，新泽西，美国）的DMEM培养基进行培养。
确定DYNLL2为败血症进展的关键风险基因
为了识别败血症进展的分子驱动因素，我们分析了基因表达组数据库（GEO）GSE65682。欧几里得距离分析的结果显示了败血症的异质性（图1A）。因此，对关键基因的表达谱进行了无监督聚类分析，将其分为不同的败血症亚型。一致性聚类分析明确将败血症患者分为亚型1和亚型2（图1B）。主成分分析（图1C）进一步……
讨论
败血症仍然是一个严重的临床挑战，其特征是宿主对感染的异常反应，导致危及生命的器官功能障碍[27]，[28]。尽管对其病理生理学的理解有所进展，但治疗选择仍然有限，这突显了迫切需要发现新的分子驱动因素和靶向疗法[29]。炎性小体是激活炎症caspases以驱动细胞焦亡和细胞因子成熟的关键细胞内信号复合体，起着核心作用……
CRediT作者贡献声明
陈周：撰写初稿、正式分析、数据管理、概念构建。卢家晨：方法学设计、正式分析、数据管理。张欣宇：方法学设计、实验研究、数据管理。赵家伟：方法学设计、实验研究、数据管理。刘一曼：正式分析、数据管理。白东升：撰写、审稿与编辑、概念构建。赵月：撰写初稿、资金争取、概念构建。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号82204409）和“双一流”大学建设项目（CPU2022QZ20）的支持。
