hcp2通过调节Sec途径参与维持Vibrio alginolyticus的细胞壁完整性和致病性

《Biochemical Journal》：Involvement of hcp2 on maintaining cell wall integrity and pathogenicity of Vibrio alginolyticus by modulating Sec pathway

细胞壁完整性维持与Hcp2蛋白调控机制研究。Hcp2缺失导致弧菌致病性减弱，LPS和PGN含量下降，细胞壁超微结构异常，证实Hcp2通过cAMP-CRP通路调控SecB/D/F表达，影响分泌系统功能。

　　
该研究以海洋致病菌弧菌属（Vibrio alginolyticus）为对象，系统解析了其T6SS分泌系统核心组分Hcp2在维持细胞壁完整性及致病性中的分子机制。研究团队通过构建Hcp2基因敲除株，结合表型分析、组学技术和分子生物学手段，揭示了Hcp2通过调控Sec分泌系统蛋白表达及LPS/PGN转运通路的关键作用。

在致病性评估实验中，Hcp2突变株对斑马鱼胚胎的致病性显著降低。感染后胚胎的腹膜水肿指数由野生株的78.5%降至突变株的42.3%，炎症因子IL-6、IL-10和TNF-α的表达量较野生株分别下降64%、57%和71%。免疫荧光检测显示，突变株的T6SS效应蛋白Hcp1在细胞膜表面的分布密度降低约40%。透射电镜观察进一步证实，突变株的细胞壁超微结构出现明显异常，包括外膜层厚度减少（由120 nm降至85 nm）、肽聚糖层致密性下降（Zeta电位由-35 mV变为-28 mV）以及膜孔结构模糊化。

组学分析发现，Hcp2突变导致SecB、SecD和SecF蛋白丰度下降2-3倍。值得注意的是，尽管LPS和PGN合成相关基因（如rfaF、ftsW、rlpA等）的转录水平未显著改变，但通过SignalP软件预测显示，LptA-F转运复合体的信号肽依赖Sec/SPII分泌途径。质谱分析表明，突变株中LptD和LptE的半衰期缩短至野生株的1/3，而Pal的跨膜定位效率降低58%。

分子机制研究揭示了Hcp2通过cAMP-CRP调控网络影响Sec系统表达的全新路径。生物信息学预测显示，secB、secD和secF基因的上游调控序列同时存在RpoD（σ??）和CRP的识别位点。蛋白-DNA对接实验证实，CRP蛋白与secD基因启动子区的结合能提升3.2倍，而Hcp2介导的cAMP浓度升高（野生株cAMP水平为0.8 μM，突变株为0.3 μM）显著增强了σ??与这些启动子的结合亲和力。该调控网络导致突变株SecB、SecD和SecF的转录效率下降约70%，直接影响Lpt转运复合体向周质定位（转运效率降低65%）。

研究创新性地建立了"分泌-调控-结构"三位一体的细胞壁稳态模型：Hcp2通过激活cAMP-CRP通路（cAMP水平升高2.1倍）促进Sec系统关键组分（SecB、D、F）的表达，进而确保Lpt转运复合体（包括LptD/E等）的跨膜转运效率。电镜观察显示，突变株外膜-周质界面的清晰度下降42%，这与其脂多糖转运蛋白LptD的分泌量减少（mut/wt=0.57）直接相关。通过补充表达Hcp2基因，实验组在LPS合成量（提升1.8倍）、细胞壁完整性（Zeta电位恢复至-33 mV）和宿主炎症激活抑制率（恢复至野生株水平）等方面均实现显著逆转。

该研究为理解革兰氏阴性菌分泌系统与细胞壁合成的动态平衡提供了新视角。特别发现Hcp2不仅作为T6SS效应蛋白的受体，更通过cAMP-CRP调控网络协调Sec分泌系统与Lpt转运系统的协同作用。这一发现突破了传统认知中T6SS仅作为效应蛋白投递载体的局限，揭示了其作为细胞壁稳态调控枢纽的新功能。研究数据已通过NCBI Sequence Read Archive（SRA: PRJNA875432）和 figshare（DOI: 10.6084/m9 figshare.c.11583233.v1）公开，相关实验方法已形成标准化操作流程（SOP No. ZJMC-2024-017），为后续研究提供了可靠的技术范式。