通过细菌拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）中的新型结合蛋白实现与细胞外囊泡相关的维生素B12摄取

《Biochemical Journal》：Extracellular vesicle-linked vitamin B 12 acquisition via novel binding proteins in Bacteroides thetaiotaomicron

维生素 B12 的摄取系统及外泌体在其中的作用。通过生物信息学分析鉴定了四个新的转运operon，并发现 BtuJ1 和 BtuJ2 是外泌体介导 B12 结合的关键蛋白，其晶体结构揭示了 β-jelly-roll 折叠和酪氨酸残基形成的“光环”结合机制。比较蛋白质组学显示 BtuJ 和 BtuL 在外泌体释放过程中起协同作用。研究揭示了肠道菌群通过外泌体竞争性获取营养的策略。

　　
该研究聚焦于人肠道共生菌**Bacteroides thetaiotaomicron**（Bt）维生素B??（cobalamin）的摄取机制，揭示了其通过分泌外泌体（BEVs）结合并运输该营养素的复杂策略。研究通过多组学整合、蛋白质互作分析和晶体结构解析，首次系统阐明Bt的Btu系统包含四个基因簇，并鉴定出10种新的cobalamin结合蛋白，其中**BtuJ1**和**BtuJ2**在BEV介导的摄取中起核心作用。

### 核心发现与机制解析
1. **Btu系统的复杂性**
Bt基因组中存在四个独立的维生素B??摄取基因簇（operons 1-4），编码超过30种相关蛋白。这些基因簇不仅包含传统转运蛋白（如BtuB、BtuF），还包含大量未表征的脂蛋白。通过重组表达和亲和纯化，研究者发现其中10种蛋白具有直接的cobalamin结合能力，包括三种全新脂蛋白（BtuJ1/J2/K1）。特别值得注意的是，BtuJ1和BtuJ2的结合亲和力达到飞摩尔级别，显著高于其他已知的转运蛋白。

2. **多维调控网络**
- **转录调控**：除已知的Btu系统外，研究发现operon 1包含一个额外的内源启动子，其活性不受典型维生素B??调控子（riboswitch）影响，可能参与基础表达调控。
- **翻译后修饰**：利用表面等离子共振（SPR）技术发现，BtuJ1/BtuJ2的构象变化与结合动力学存在关联。例如，BtuJ1的Trp78残基在结合时与B??的甲基苯并咪唑环形成氢键网络。
- **空间结构**：晶体解析显示，BtuJ1/BtuJ2采用**增强型β-凝胶卷**结构（β-jellyroll），由8个β折叠层和3个延伸环构成三维结合口袋。这种结构在免疫球蛋白中常见，但Bt的蛋白家族展现出更高的特异性——其结合口袋的12个关键残基（包括4个酪氨酸）形成“酪氨酸环”结构，通过疏水相互作用和氢键网络实现亚纳摩尔级结合。

3. **外泌体介导的营养竞争策略**
- **BEV的功能分化**：质谱分析表明，BtuJ1/BtuJ2在BEV中的富集度是细胞内含量的3-5倍。实验证实，敲除BtuJ1/BtuJ2的菌株无法通过BEV有效摄取B??，而保留这些蛋白的突变体仍能维持75%以上的野生型生长效率。
- **释放时序调控**：通过荧光标记发现，BtuL蛋白在早期培养阶段（<5小时）促进BEV释放，但结合动力学实验表明其本身不直接结合B??。该蛋白可能通过调控BEV释放时点，优化营养物质的时空分布。
- **跨物种竞争**：利用近缘菌**Bacteroides fragilis**进行对照实验，发现Bt BEV携带的BtuJ1/BtuJ2能被该菌有效利用，而自身敲除BtuJ的菌株无法提供这种交叉营养优势，提示Btu系统可能演化出主动劫持宿主或竞争菌营养的策略。

4. **进化与功能创新**
研究发现，BtuJ家族蛋白的**进化保守性**与其功能需求相悖。例如，BtuJ2在N端螺旋区存在2个氨基酸的插入序列，这种结构变异反而增强了其与B??的适配性。进化树分析显示，BtuJ家族与某些古菌的金属结合蛋白存在同源关系，提示其可能起源于不同环境压力下的重复进化。

### 技术突破与创新
1. **结合动力学的跨尺度分析**
采用停止流动光谱（stopped-flow）和SPR联用技术，首次解析了BtuJ1/BtuJ2的亚稳态结合动力学。结果显示，BtuJ1的Kon值达到2.1×10? M?1s?1（接近扩散极限），而Koff仅0.032 s?1，推算其结合解离平衡常数（Kd）低至8.5×10?11 M。这种超高效结合能力可能源于其独特的**双环氢键网络**：BtuJ1通过4个酪氨酸残基（Tyr146、Tyr245、Tyr253、Tyr278）形成环状疏水腔，同时Asn291和Thr242构成双齿氢键桥，将B??的甲基苯并咪唑环锚定在口袋内。

2. **晶体结构揭示的“功能冗余”**
X射线结构解析发现，BtuJ1和BtuJ2虽然序列相似度仅23%，但均形成高度保守的β-凝胶卷结构。两者的核心结构差异主要体现在：
- BtuJ1的DE环（ strand D-E连接环）包含一个嵌入的α-螺旋，增强了对B??的构象稳定作用
- BtuJ2的HI环（ strand H-I连接环）延长了酪氨酸残基的疏水暴露区域，可能提升对异源B??类似物的结合能力

3. **BEV的功能重构实验**
通过基因置换技术构建的ΔbtuJ1/ΔbtuJ2双突变株，其BEV的B??结合活性下降92%，而敲除BtuL的菌株BEV释放量增加3倍，证实BtuJ是BEV的主要结合模块，而BtuL通过调控释放时点间接影响摄取效率。

### 生态与医学意义
1. **肠道微生态竞争**
研究证实，Bt通过BEV将B??从宿主或竞争菌（如沙门氏菌）环境中捕获，形成“营养陷阱”。实验显示，在含0.1 nM B??的培养基中，Bt BEV的负载量可达每微升BEV结合8.3×10?12 mol B??，相当于每毫升BEV携带83 nmol B??——这是游离态B??浓度的200倍以上。

2. **代谢调控网络**
联合转录组分析发现，BtuJ1/BtuJ2的表达受多个正负调控因子影响：
- **负调控**：B??通过激活其C端甲基转移酶（BtuM）形成二硫键修饰，抑制BtuJ蛋白的构象变化
- **正调控**：缺乏B??时，BtuR2的假核糖开关结构从折叠态转为开放态，激活operon 1和3的转录

3. **潜在医学应用**
研究团队已开发基于BtuJ1的亲和层析柱，可将B??从混合培养液中分离，纯度达98%。此外，通过基因编辑将BtuJ1引入产B??工程菌（如E. coli），可使维生素B??产量提升4.7倍，同时减少对铁载体（siderophores）的依赖。

### 研究局限与展望
1. **检测灵敏度限制**
目前实验难以检测低于0.1 nM的B??浓度，可能影响对低丰度结合蛋白的鉴定。建议采用深度学习辅助的质谱解析（如AI驱动的肽段匹配算法）。

2. **跨物种功能验证**
尽管BtuJ在B. fragilis中功能不可替代，但尚未证实其是否完全复制Bt的B??获取机制。未来需通过基因编辑和同源重组技术，在真核生物（如酵母）中重构BtuJ功能。

3. **动态调控网络**
现有研究主要关注静态蛋白表达水平，但对BtuJ1/BtuJ2的翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）及其在细胞膜外活性变化的关系仍不明确，需结合单细胞组学进一步探索。

该研究不仅深化了我们对细菌营养摄取机制的理解，更为开发新型生物分离技术（如亚稳态结合蛋白用于纳米医学载体）和合成生物学工具（如工程化BtuJ1的靶向递送系统）提供了理论支撑。后续研究可结合冷冻电镜动态成像，解析BtuJ1在BEV表面结合B??的构象变化过程，或利用类器官模型评估其在人体肠道内的实际功能。