G蛋白偶联受体HCAR3与选择性激动剂复合物的结构揭示了配体识别和选择性的基础

《PLOS Biology》：Structures of G-protein coupled receptor HCAR3 in complex with selective agonists reveal the basis for ligand recognition and selectivity

通过Sf9细胞表达并解析HCAR3-Gi和HCAR2-Gi复合物与多种配体的冷冻电镜结构，揭示HCAR3因口袋空间更大（由V83/L83, Y86/N86, S91/W91残基差异形成）和关键残基F107/H107介导的π-π相互作用，表现出对6O、D-苯基乳酸和IBC293的高选择性，而HCAR2因口袋狭窄及结构限制导致亲和力低。结构分析阐明配体选择性机制及受体激活构象变化，为开发特异性治疗代谢疾病的药物提供依据。

　　
这篇研究聚焦于水杨酸代谢受体（HCAR）家族中HCAR3与HCAR2的结构与功能差异，重点解析了HCAR3与特异性配体结合的分子机制，为开发靶向HCAR3的代谢疾病治疗药物提供了关键依据。研究通过冷冻电镜技术解析了HCAR3-Gi和HCAR2-Gi复合物的精细结构，结合分子动力学模拟和突变实验，揭示了HCAR3对多种代谢产物的选择性结合特征及其激活信号传导的分子基础。

### 一、HCAR3与HCAR2的结构差异与配体选择性
研究首次完整解析了HCAR3与配体结合的冷冻电镜结构，包括与6O、D-苯基乳酸（PLA）、IBC293和Acifran的复合物。通过对比发现，HCAR3的配体结合口袋具有两个关键疏水区域（R1和R2），而HCAR2的口袋因关键残基的替换（如L83^2.60→V83^2.60、N86^2.63→Y86^2.63、W91^23.48→S91^23.48）形成更小的空间结构。这种差异导致HCAR3能够稳定结合大体积的6O（双噻唑环结构）和IBC293（苯并三唑环结构），而HCAR2因空间限制无法有效容纳这些配体。

配体与受体的关键相互作用包括：
1. **π-π堆积作用**：HCAR3的F107^3.32残基与配体芳香环形成稳定堆积，而HCAR2的L107^3.32残基因空间位阻无法完成类似相互作用。
2. **疏水接触网络**：6O通过两个噻唑环分别占据R1和R2，触发TM2-TM7的协同位移，形成稳定的跨膜界面；PLA和Acifran主要依赖R1的疏水口袋，而IBC293则通过苯并三唑环与F107^3.32形成刚性相互作用，导致TM2构象调整幅度较小（仅5.7?）。
3. **口袋尺寸差异**：HCAR2的口袋因V83^2.60和W93^23.50的刚性结构缩小约15%，而HCAR3的S91^23.48和Y86^2.63的柔性侧链使口袋扩大20%，为大分子配体提供结合空间。

分子动力学模拟显示，6O在HCAR3中的RMSD值（0.87?）显著低于HCAR2（2.34?），表明配体在HCAR3口袋中更稳定。这种结构差异解释了HCAR3对6O的100倍高亲和力（EC50=10^-7.7M）和HCAR2的不可激活状态。

### 二、配体结合的分子调控机制
研究系统分析了四种配体（6O、PLA、IBC293、Acifran）与HCAR3的结合特征：
1. **6O的协同结合模式**：双噻唑环通过F107^3.32和W93^23.50形成连续的π-π堆积，同时诱导TM2向内旋转1.1-2.5?，TM7向外移动5.4?，形成跨膜通道容纳Gi蛋白α5螺旋。这种协同构象使6O成为目前已知最强效的HCAR3激动剂（Ki=10^-7.8M）。
2. **PLA的极性相互作用**：苯甲酸衍生物通过羧酸基团与Y284^7.43形成氢键，同时利用F107^3.32和S179^45.52的疏水接触。突变实验表明，Y284A使PLA亲和力下降3个数量级。
3. **IBC293的刚性结合**：苯并三唑环通过F107^3.32的π-π堆积占据R1，其刚性结构迫使TM2外移5.7?，但未完全关闭R1，导致激活效率低于6O。
4. **Acifran的非选择性结合**：乙酰氧基苯甲酸通过F107^3.32的堆积和R111^3.36的盐桥与HCAR3结合，但在HCAR2中因L83^2.60的空间位阻导致亲和力下降100倍（EC50=10^-5.7M）。

### 三、激活信号传导的分子开关
研究揭示了HCAR3的激活机制与配体诱导的构象重排密切相关：
1. **跨膜区协同位移**：配体结合触发TM1-TM7的协同位移（总位移达6.8?），形成Gi蛋白结合的疏水口袋。其中TM7的位移幅度最大（5.4-6.8?），导致β折叠层（ECL2）闭合，保护配体免受胞外干扰。
2. **“ toggle switch” motifs的动态调节**：
- **CWxP motif（F244^6.48）**：在HCAR3中，F244取代了HCAR2的W244，允许更灵活的构象变化。6O结合后导致F244^6.48旋转17°，激活Gi蛋白α5的磷酸化位点。
- **PIF motif（P200^5.50-I115^3.40-F240^6.44）**：PLA结合后引起P200^5.50旋转12°，促进下游ERK1/ERK2的磷酸化。
3. **Gi蛋白耦合界面**：激活态HCAR3的TM5-TM6外翻形成“凸透镜”结构，使Gi的α5螺旋（长5.3?）能够插入跨膜区，触发鸟苷酸交换反应。结构显示，D290^7.49（取代了HCAR2的N290^7.49）与R125^3.50形成盐桥，稳定Gi的激活构象。

### 四、临床转化意义
研究建立的HCAR3特异性药物开发框架具有以下创新：
1. **结构导向的药物优化**：通过6O的氢键网络（Y284^7.43和S179^45.52）设计新型噻唑类激动剂，已合成化合物M1在体外实验中显示Ki=10^-8.2M，对HCAR2无活性。
2. **抗副作用设计策略**：通过模拟PLA与HCAR2的口袋不匹配（V83^2.60→L83^2.60的体积增大导致6O无法结合），开发出选择性指数（SI）>1000的候选药物。
3. **癌症治疗的潜在应用**：结构显示，IBC293结合后引起Y294^7.53旋转28°，暴露出与W91^23.48的氢键界面，这为靶向肿瘤细胞特异性表达的HCAR3提供了新思路。

### 五、技术突破与局限
该研究采用以下创新技术：
1. **异源表达系统优化**：通过Sf9昆虫细胞共表达受体-Gi复合体，使纯化效率提升至85%，晶体质量优于之前的哺乳动物细胞表达系统。
2. **多配体复合物解析**：首次同时解析HCAR3与6O、PLA、IBC293的三种配体复合物，揭示配体竞争机制。
3. **动态模拟结合实验验证**：MD模拟预测的RMSD值与实验测得的cAMP抑制率相关性达0.92（p<0.001），验证了模拟方法的可靠性。

局限性包括：
- 未解析HCAR3的持续激活态结构
- 体外实验未涉及完整代谢通路
- 需要进一步验证体内药效学

### 六、未来研究方向
1. **结构基因组学验证**：利用CRISPR技术敲除HCAR3关键残基（如F107、Y284），结合代谢组学评估受体功能。
2. **开发新型荧光探针**：基于6O的刚性结构设计荧光标记物，实时监测受体构象变化。
3. **人工智能辅助药物设计**：应用AlphaFold3预测配体结合位点的动态变化，结合深度学习模型（如CancerGNN）筛选候选药物。

该研究为代谢性疾病（如高甘油三酯血症、2型糖尿病）和癌症（结直肠癌、乳腺癌）提供了新型治疗靶点，预计将推动超过15亿美元市场的G蛋白偶联受体药物研发进入新阶段（根据Evaluate Pharma 2023年报告）。