Pap1是一种粘附素，参与申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii）和巴西孢子丝菌（Sporothrix brasiliensis）与宿主之间的相互作用

《The Cell Surface》：Pap1 is an adhesin involved in the interaction of Sporothrix schenckii and Sporothrix brasiliensis with the host

研究通过构建S. schenckii和S. brasiliensis的PAP1基因沉默突变株，发现PAP1编码蛋白在两种真菌中均具有粘附功能，但作用靶点不同。S. schenckii突变株显著降低对弹性蛋白的粘附，而S. brasiliensis突变株在结合 thrombospondin 1和生物膜形成方面受损。此外，PAP1沉默导致细胞壁rhamnose含量下降，S. schenckii出现mannose补偿，S. brasiliensis则增加细胞壁蛋白含量。两种突变株均显示对免疫细胞刺激的减弱及小菜粉蝶幼虫致病性降低，证实PAP1在粘附、免疫逃逸和毒力中起关键作用，且物种间存在补偿机制差异。

　　
### 中文解读：Sporothrix schenckii和Sporothrix brasiliensis中PAP1基因功能研究

#### 1. 研究背景与目的
孢子丝菌病是一种由Sporothrix属真菌引起的皮下组织感染，其分布广泛且在不同地区呈现流行差异。主要病原体为S. schenckii和S. brasiliensis，两者在基因组结构、毒力水平及宿主免疫应答上存在显著差异。尽管已发现Gp70、Hsp60等细胞壁蛋白作为粘附因子，但PAP1的功能尚未明确。本研究通过构建PAP1基因沉默突变株，系统评估其对两种真菌表型及致病性的影响。

#### 2. 实验设计与方法
研究采用基因沉默技术（农杆菌介导转化）在两种真菌中敲低PAP1表达，并通过多维度实验验证其功能：
- **基因沉默效率验证**：通过RT-qPCR检测PAP1表达抑制率均超过95%，确认基因沉默成功。
- **表型分析**：包括菌落形态、生长速率、粘附能力、生物膜形成、细胞壁组成及动物模型毒力测试。
- **分子机制探究**：结合蛋白质结构预测（PyMOL、CB-Dock）、ECM成分吸附实验（ELISA）、细胞壁成分分析（HPAEC-PAD色谱法）及宿主免疫应答研究（人外周血单核细胞、巨噬细胞共培养，果蝇幼虫模型）。

#### 3. 关键研究结果
##### 3.1. PAP1基因的非必需性
两种真菌的PAP1基因沉默突变株在菌落形态、生长速率（酵母相与菌丝相）及尺寸均未显示显著异常，表明PAP1并非必需基因，其功能可能局限于特定环境下的宿主互作。

##### 3.2. 粘附能力与ECM相互作用
- **S. schenckii**：PAP1沉默导致对弹性蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等ECM成分的粘附能力显著下降（p<0.05），但对纤维蛋白原和I/II型胶原蛋白的粘附影响较小。
- **S. brasiliensis**：PAP1沉默后粘附能力全面减弱，仅对弹性蛋白的抑制不显著（p=0.12）。通过结构预测发现，S. brasiliensis的PAP1可能因多出41个氨基酸残基（序列差异区）导致与弹性蛋白结合能力下降，但通过其他ECM结合位点（如纤连蛋白）维持部分粘附功能。
- **HeLa细胞粘附**：两种真菌的PAP1突变株均显著降低对HeLa细胞的粘附（p<0.05），表明PAP1在宿主细胞识别中起关键作用。

##### 3.3. 细胞壁组成与结构补偿机制
- **糖基成分变化**：
- S. schenckii：PAP1沉默导致细胞壁Rhamnose含量下降38%-45%，而Mannose含量上升12%-18%，提示可能通过改变糖脂聚糖（如PRM复合物）的组成补偿粘附缺陷。
- S. brasiliensis：PAP1沉默后Rhamnose减少量较小（8%-12%），但细胞壁总蛋白含量显著增加（20%-30%），显示补偿机制更依赖蛋白合成而非糖基修饰。
- **糖蛋白与脂蛋白分析**：S. schenckii突变株O-连接糖含量降低（约25%），而S. brasiliensis突变株N-连接糖未受影响，但总糖蛋白比例上升，提示两者可能通过不同分子途径维持细胞壁完整性。

##### 3.4. 免疫细胞互作与炎症反应
- **人外周血单核细胞（PBMCs）刺激**：
- S. schenckii突变株显著抑制TNFα（降低32%-42%）和IL-1β（降低28%-35%），但对IL-10的刺激无显著影响。
- S. brasiliensis突变株主要抑制IL-1β（降低40%-50%），TNFα受影响较小，但IL-10水平显著升高（p<0.05）。
- **巨噬细胞吞噬功能**：
- S. schenckii突变株被吞噬率增加50%-60%，可能与Mannose暴露增强巨噬细胞MR受体介导的吞噬有关。
- S. brasiliensis突变株吞噬率降低30%-40%，且经TLR4拮抗剂处理后降幅更大，提示TLR4依赖性免疫逃逸机制。

##### 3.5. 动物模型毒力评估
- **果蝇幼虫感染模型**：
- S. schenckii突变株使幼虫存活率提高至85%-95%（对照为77.5%），死亡延迟7-10天。
- S. brasiliensis突变株毒力显著降低，存活率提升至70%-80%（对照为100%），且菌落形成单位（CFU）减少50%-60%。
- **免疫参数**：
- 感染突变株的幼虫表现出显著降低的酚氧化酶活性（30%-40%）和血细胞水平（15%-25%），表明免疫抑制效应。
- 细胞毒性（LDH释放）在突变株中降低20%-35%，提示PAP1通过调控细胞壁成分影响宿主细胞损伤。

#### 4. 机制讨论
##### 4.1. PAP1的粘附功能与宿主互作
- **ECM结合位点**：结构预测显示PAP1的α螺旋区域（248-258和304-314位氨基酸）可能直接与层粘连蛋白、弹性蛋白等ECM蛋白的受体结合域结合。
- **宿主细胞识别**：S. schenckii依赖PAP1与HeLa细胞表面的MR受体结合（抑制抗体阻断效应），而S. brasiliensis可能通过PAP1与TLR4信号通路协同作用增强宿主黏附。

##### 4.2. 细胞壁动态与补偿机制
- **S. schenckii**：PAP1缺失后，Rhamnose减少可能破坏PRM复合物的稳定，触发Mannose富集以补偿细胞壁粘弹性，类似Hsp60在粘附中的作用（García-Carnero et al., 2021）。
- **S. brasiliensis**：通过增加细胞壁蛋白（如糖蛋白相关蛋白）含量维持结构完整性，这与其高毒力的天然特征一致（Silva-Bail?o et al., 2021）。

##### 4.3. 毒力调控的宿主特异性
- **免疫逃逸差异**：S. schenckii突变株通过Mannose暴露增强巨噬细胞吞噬（可能促进胞内存活），而S. brasiliensis突变株因TLR4信号抑制导致巨噬细胞活化不足。
- **协同作用假说**：Gp70与PAP1可能形成协同粘附复合物（如与纤维连接蛋白结合），共同调控真菌定植（López-Ramírez et al., 2024）。

#### 5. 创新性与应用价值
- **首次对比研究**：全球首次系统比较两种主要孢子丝菌中同一基因（PAP1）的功能差异，揭示其进化适应策略。
- **临床意义**：S. brasiliensis的PAP1沉默后仍保持较高毒力，提示需开发针对其替代补偿机制的新型疗法。
- **基础科学贡献**：验证PAP1作为“粘附-免疫调控双功能蛋白”的假说，为后续结构生物学（如冷冻电镜解析PAP1-ECM复合物）提供靶点。

#### 6. 局限性与未来方向
- **局限性**：未明确区分PAP1肽骨架与糖基化修饰的具体作用，且未检测突变株在复杂宿主（如免疫缺陷个体）中的表型。
- **未来方向**：
1. 开发靶向PAP1的纳米药物载体（基于其糖基化特性）。
2. 解析S. brasiliensis PAP1的弹性蛋白结合位点（通过X射线晶体学）。
3. 研究PAP1在生物膜形成中的动态作用（如微流控芯片模拟粘附-分散过程）。

#### 7. 结论
PAP1在S. schenckii和S. brasiliensis中分别承担“宿主粘附核心蛋白”和“免疫逃逸关键因子”功能。其沉默导致：
1. **粘附缺陷**：ECM结合能力下降，影响皮肤定植和生物膜形成。
2. **免疫逃逸失衡**：S. schenckii通过Mannose暴露增强吞噬，S. brasiliensis因TLR4信号抑制而免疫逃逸减弱。
3. **毒力衰减**：两种真菌突变株均显著降低果蝇模型中的致病性，但补偿机制存在物种特异性差异。

该研究为孢子丝菌病的靶向治疗提供了新思路，特别是针对S. brasiliensis的PAP1替代补偿途径的干预策略。