对Lasiodiplodia属提取物的化学成分进行生物勘探与研究：通过相似性计算评估特异性代谢物，并利用差分1H核磁共振（differential 1H NMR）技术实现代谢物的去重复（dereplication）

《Fitoterapia》：Bioprospecting and exploration of the chemical profile of Lasiodiplodia sp. extracts: Evaluation of specialized metabolites by similarity calculations, and dereplication with differential 1H NMR

内生真菌 Lasiodiplodia sp. 在优化培养基中通过差异 1H NMR 分析，鉴定出 6 种已知化合物（3-羧基-2-甲烯基-4-庚醇酯、癸基酸等），并揭示代谢多样性随培养条件（碳氮源、发酵时长、提取方法）变化。

　　

卢卡斯·席尔瓦·蒂罗尼（Lucas Silva Tironi）|约翰·马特奥·里奥斯·马林（Johan Mateo Rios Marin）|奥马尔·卡贝萨斯·戈麦斯（Omar Cabezas Gómez）|安东尼奥·吉尔贝托·费雷拉（Antonio Gilberto Ferreira）|扬·施里普塞马（Jan Schripsema）|杰恩·奥诺拉塔·霍尔托兰·路易斯（Jaine Honorata Hortolan Luiz）

巴西米纳斯吉拉斯州阿尔费纳斯（Alfenas）的阿尔费纳斯联邦大学（Federal University of Alfenas）化学研究所

摘要

内生真菌以产生多种特化代谢物而闻名，这些代谢物通常具有复杂多样的化学结构。在这项研究中，差异¹H NMR技术被作为一种创新工具，用于复杂混合物中的化合物鉴定，并通过相似性计算来评估连续培养Lasiodiplodia菌株所得提取物的化学特征。对POLd-14提取物以及MLd-1至MLd-3亚组分的一维（1D）和二维（2D）NMR分析，鉴定出了已知化合物：POLd-14中的3-羧基-2-亚甲基-4-庚内酯（1）和脱氢松香酸（2）；MLd-1和MLd-3中的吲哚-3-羧酸（3）；MLd-1中的4-羟基苯甲酸（4）和4-羟基梅莱因（5）；以及MLd-2中的4-羟基苯乙酰胺（6）。差异¹H NMR技术使得这些化合物的鉴定更加明确。这些结果有助于生物勘探，并更好地理解Lasiodiplodia菌株在不同培养条件下的代谢物多样性，包括碳源和氮源、培养时间以及提取方法的变化。该研究还强调了Lasiodiplodia内生真菌作为具有药理活性的生物活性代谢物来源的潜力，其可通过不同条件进行培养以产生多种特化代谢物。

引言

自1928年青霉素被发现以来，微生物作为具有药理和生物技术应用价值的代谢物来源日益受到重视，逐渐超越植物成为生物活性化合物的主要提供者。在这一背景下，与药用植物相关的内生真菌因其产生具有治疗潜力的物质的能力而引起了越来越多的科学关注[1]。其中，Lasiodiplodia属因其次级代谢物的多样性而特别值得关注，这些代谢物表现出抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫、抗炎和抗氧化等活性[2]。这些特性使该属成为通过培养发现新生物活性化合物的科学探索的重点。

值得注意的是，真菌产生的代谢物会因培养基和环境条件而显著变化，尤其是在营养过剩或不足的情况下[3]。这种变异性对于生物勘探具有重要意义，因为调整培养参数可以刺激新型或具有治疗相关性的生物活性化合物的产生。因此，在多种发酵条件下探索内生真菌是一种有前景的策略，有助于发现可能在制药行业及其他领域有应用的新代谢物[3]。

尽管目前色谱-质谱联用技术是分析复杂混合物最广泛使用的方法（因其对天然来源化合物的识别具有高灵敏度[4]），但NMR仍然是代谢物鉴定不可或缺的工具。NMR具有独特优势，尤其是在纯化困难（由于技术限制、样品量有限或成本高昂）的情况下。此外，它是一种稳健可靠的技术，需要更简单的样品制备过程，消耗更少的溶剂，并产生更少的废弃物[5]。NMR的主要优势在于它可以直接在混合物中鉴定化合物，无需分离步骤，这不仅简化了工作流程，还使得对新物质的搜索更加有针对性[6]。在这方面，使用¹H NMR相似性计算和差异分析的新方法正受到关注，尽管它们的研究仍不如质谱技术广泛[7]。

基于此背景，本研究调查了从药用植物Handroanthus impetiginosus中分离出的内生真菌Lasiodiplodia菌株提取物的化学特征。我们研究了不同培养期间代谢物组成的变化，并评估了培养基组成、发酵时间和提取方法对代谢物产生的影响。这种方法深入探讨了真菌与其生长条件之间的相互作用，利用NMR监测代谢物的动态变化，并识别出具有治疗潜力的潜在生物活性化合物。

章节摘录

真菌的分离与鉴定

Lasiodiplodia菌株是从Handroanthus impetiginosus的健康叶片中分离出来的。首先用70%乙醇对叶片进行表面消毒，然后用4%次氯酸钠溶液处理。消毒后，将叶片切成小块并放置在含有马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的培养皿上。新出现的真菌菌落反复在同一培养基上进行传代培养，直到获得纯培养物，具体步骤遵循Moreira等人的描述[8]。

混合物中细胞外化合物的鉴定 – 优化的Czapek培养基

在优化的Czapek培养基中培养的Lasiodiplodia菌株的化学研究表明，培养基组成对产生的次级代谢物多样性有显著影响。众所周知，这些化合物的生物合成会受到补充物质和培养条件的显著影响[3]。Lasiodiplodia属的菌株能够合成多种生物活性化合物，包括环己烯类和缩酮类等。

讨论

NMR光谱相似性可以作为初步分析方法，帮助解释实验结果。这种方法在比较研究中特别有用，因为强度或化学位移的微小变化可能表明化学特征存在显著差异。然而，在复杂系统中，仅依赖相似性可能会导致误解，因为信号重叠或低丰度代谢物的存在可能被忽略。有多种方法和算法可以用于此目的

结论

通过使用综合¹H NMR技术分析Lasiodiplodia菌株提取物的化学特征，无需纯化即可鉴定出多种在真菌培养过程中产生的代谢物。结果显示，化学特征随时间发生变化，受到培养时间、提取方法和真菌可利用的营养成分等因素的影响。

¹H NMR光谱相似性分析揭示了不同采集时间点提取物之间的强烈相关性

CRediT作者贡献声明

卢卡斯·席尔瓦·蒂罗尼（Lucas Silva Tironi）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据可视化，方法学研究，数据分析，概念构建。约翰·马特奥·里奥斯·马林（Johan Mateo Rios Marin）：方法学研究，概念构建。奥马尔·卡贝萨斯·戈麦斯（Omar Cabezas Gómez）：方法学研究，数据分析，概念构建。安东尼奥·吉尔贝托·费雷拉（Antonio Gilberto Ferreira）：方法学研究，数据分析。扬·施里普塞马（Jan Schripsema）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，软件应用，方法学研究，数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

卢卡斯·席尔瓦·蒂罗尼（Lucas Silva Tironi）和约翰·马特奥·里奥斯·马林（Johan Mateo Rios Marin）感谢CAPES提供的奖学金。本研究部分由巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）资助（资助代码001）。