代谢组学与心脏功能跨模态整合揭示多柔比星在工程化心脏组织中的动态代谢毒性效应

《Stem Cell Reports》：Cross-modal integration of metabolomics and cardiac functionality captures dynamic metabotoxic effects of doxorubicin in engineered heart tissues

本研究针对药物心脏毒性评估中分子机制不明确的问题，开发了结合3D工程化心脏组织(3D-EHTs)与拓扑数据分析(TDA)的创新平台，通过整合代谢组学与心脏收缩功能数据，首次系统揭示了多柔比星(DOXO)引起的心脏毒性存在剂量和时间依赖性的中央碳代谢(CCM)重编程，鉴定出20个与心脏功能相关的代谢物，其中9个为首次发现，为临床前药物心脏毒性评估提供了新范式。

　　

药物开发是一个漫长且成本高昂的过程，平均每种分子需要10-15年和高达28亿美元的资金投入。然而，超过90%的药物研发项目以失败告终，主要原因是临床疗效不足(40%-50%)和不可控的毒性反应(30%)。多柔比星(DOXO)作为一种高效的抗癌药物，对多种实体瘤和血液恶性肿瘤表现出显著疗效，但其临床应用却因严重的心脏毒性而受到限制。DOXO诱导的心脏毒性(DiC)可导致从心电图异常(高达50%的患者)到亚临床心功能不全(高达17.9%的患者)，甚至严重心肌病和充血性心力衰竭(高达9%的患者)等一系列心脏问题。尽管其临床重要性毋庸置疑，但DiC的病理生理机制仍存在争议且尚未完全阐明。

传统的心脏临床前研究主要依赖动物模型(体内)、心脏组织(离体)和心脏细胞培养(体外)。虽然动物模型能够提供机体水平的生理反应，但其应用受到伦理关切、高成本、需要专用基础设施以及种间病理生理差异等因素的限制，这些差异会损害结果的可靠性及其向人类医学的转化。同样，人类心脏组织的离体样本也面临伦理问题、获取有限以及健康对照组织稀缺等挑战。另一方面，人类二维心脏细胞培养(无论是原代心肌细胞(CMs)还是干细胞来源的心肌细胞)虽然能提供丰富信息，但在重现心脏的复杂性、功能性和病理生理学方面存在不足。

近年来，心脏组织工程领域的进展使得能够在体外生成三维心脏模型，这些模型能够重现心脏组织的功能特征，同时保留人类来源的优势。尽管功能性三维心脏模型为临床前生理研究提供了新的可能性，但通过基于先进质谱技术的组学(如代谢组学)对这些模型进行深入的分子表征仍然缺乏。将生理学和分子数据整合起来，可以极大地推进对药物代谢和心脏毒性的临床前理解，拓宽这些心脏模型在临床试验前药物评估中的应用。

本研究开发了一个创新的平台和数学框架，用于在三维工程化心脏组织(3D-EHTs)中顺序性和整合性地评估药物心脏毒性的功能和代谢效应。该研究的核心是拓扑数据分析(TDA)，这一创新的数学框架能够识别不同模态(如收缩力(FoC)和代谢谱)之间的关联，从而加速体外药物反应相关代谢机制的假设生成和验证。

研究人员首先优化了一种在柱上提取极性代谢物的方案，该方案可在测量心脏收缩功能后直接从单个3D-EHTs中提取代谢物，最大限度地减少了组织操作和处理时间，降低了人为代谢变化和样品制备变异性的风险。随后，他们利用人类诱导多能干细胞(hiPSC)来源的心肌细胞生成3D-EHTs，并用1μM或5μM的多柔比星进行处理，分别在0小时、24小时和48小时时间点评估其收缩功能和中央碳代谢谱。

通过三种靶向液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)方法(基于三乙胺(TEA)、三丁胺(TBA)和乙酸(AA)的方法)，研究人员成功检测并定量了48种与中央碳代谢和能量稳态相关的代谢物。为了整合这些异质性、高维度的代谢组学数据与功能数据(收缩力)以及处理条件(剂量和时间)，研究团队采用了拓扑数据分析中的Mapper算法，构建了一个拓扑连通网络(TCN)。该网络模型揭示了样本之间基于其代谢谱的关联性，并能够区分具有不同收缩力水平和处理条件的样本。

为了将分类元数据(如处理类型、时间点)转化为可用于标准统计分析定量数据，研究人员开发了一种基于拓扑节点富集(TNE)的新方法。该方法通过计算每个节点内样本特定模态(如代谢物水平、收缩力)的平均值，从而实现对不同模态之间关联强度的定量评估。研究结果显示，TNE方法与独立于TDA框架计算的关联性估计值高度一致，验证了其可靠性。

通过TNE分析，研究人员发现20种代谢物与心脏收缩力密切相关，并受到多柔比星剂量和暴露时间的显著影响。其中，己糖磷酸盐和戊糖磷酸盐与高剂量多柔比星处理(5μM, 48小时)呈强正相关，但与收缩力呈负相关。相反，三羧酸循环代谢物(如富马酸、苹果酸)和肉碱酯则显示出相反的关联模式。值得注意的是，尿苷-5'-二磷酸(UDP)-葡萄糖醛酸、醛糖酸以及N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸(GlcNAc-1P)和N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)等一些代谢物被首次发现与多柔比星心脏毒性相关。

研究人员通过弦图进一步可视化了在多柔比星处理下与收缩力显著相关的代谢物其与处理条件(剂量，时间)和收缩力之间关联的变化。结果显示，在未经处理的EHTs中，代谢物与收缩力的关联方式与标准培养条件一致。然而，在使用多柔比星处理后，开始出现关联符号转换(SAS)的现象，即代谢物与收缩力正相关，但与处理剂量和时间负相关，或者反之。特别是在5μM多柔比星处理48小时后，显示SAS的代谢物数量增加了一个数量级，这表明在高剂量长时间处理下，多柔比星对心脏代谢产生了更为复杂和广泛的影响。

优化代谢物提取方案

研究人员开发了一种顺序性功能评估和代谢组学分析方案，首先记录3D-EHTs的收缩力，随后立即进行在柱上极性代谢物提取。通过优化洗涤步骤和提取缓冲液孵育时间，确定了10分钟为达到最大代谢物回收率的最短孵育时间。提取后的代谢物通过三种靶向LC-MS/MS方法进行分析。

3D-EHTs的生成与多柔比星处理

使用商业hiPSC细胞系"WTC"生成心肌细胞，并通过代谢选择(葡萄糖饥饿和乳酸喂养)提高心肌细胞纯度。将心肌细胞与少量人心脏成纤维细胞(CFs)混合，并在定制化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)支柱上形成3D-EHTs。培养10天后，用DMSO(对照)、1μM或5μM多柔比星处理EHTs，并在不同时间点评估收缩功能和代谢谱。

数据整合与拓扑数据分析

将代谢组学数据通过Z-score标准化后，使用均匀流形近似与投影(UMAP)进行非线性降维。随后应用Mapper算法构建拓扑连通网络(TCN)，整合来自三种代谢组学方法的数据。通过拓扑节点富集(TNE)方法将分类元数据转化为定量数据，并计算Spearman等级相关系数来评估代谢物与感兴趣元数据之间的关联强度。

代谢组学揭示多柔比星诱导的剂量和时间依赖性代谢重编程

通过三种靶向代谢组学方法，研究人员发现多柔比星处理引起了3D-EHTs中央碳代谢的显著变化。基于TEA的方法显示，大多数核苷酸糖在多柔比星处理的EHTs中升高，尤其是24小时1μM DOXO处理的样本。基于TBA的方法表明，己糖磷酸盐和唾液酸在48小时多柔比星处理的EHTs中达到最高水平。基于AA的方法检测到腺苷、天冬氨酸、谷氨酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、丙酮酸和琥珀酸在48小时5μM DOXO处理的EHTs中水平最高。

拓扑数据分析成功整合功能与代谢数据

构建的拓扑连通网络揭示了两个不同的连通组件(A和B)。组件A包含的节点显示出高连通性，主要包含对照样本(用DMSO处理)，而组件B的节点连通性较低，排列呈细长状，主要包含多柔比星处理的样本。通过着色节点可以发现，高收缩力的样本集中在组件A，而低收缩力的样本集中在组件B。网络模型仅基于分子数据就能区分具有不同收缩力值的样本。

节点富集定量揭示代谢物与心脏功能的关联

通过拓扑节点富集和层次聚类分析，研究人员发现36种代谢物与多柔比星处理剂量和时间存在轻度到强度的关联。代谢图显示，己糖磷酸盐和戊糖磷酸盐与未经处理的EHTs呈强负相关，而与1μM和5μM多柔比星处理呈强正相关。相反，三羧酸循环代谢物和肉碱酯则显示出相反的模式。弦图分析特别显示，在5μM多柔比星处理48小时后，有19种代谢物显示出关联符号转换，表明多柔比星对心脏代谢产生了复杂的影响。

本研究通过整合先进的心脏组织工程、最先进的组学技术和新颖的数学方法，为药物效应和心脏毒性的临床前研究提供了新的范式。研究不仅揭示了多柔比星引起的心脏毒性存在剂量和时间依赖性的中央碳代谢重编程，还鉴定出20个与心脏功能相关的代谢物，其中9个为首次发现与多柔比星心脏毒性相关。这些发现为理解多柔比星心脏毒性的分子机制提供了新的视角，也为临床前药物心脏毒性评估提供了更为强大的工具。

该研究展示的TDA引导的分析框架不仅适用于3D-EHTs，也适用于其他类型的心脏模型，如心脏球体和心脏类器官，为未来更全面地评估药物心脏毒性奠定了基础。通过将不同层次的信息整合起来，这一方法有望提高临床前药物开发的预测能力，降低失败率，最终加速安全有效药物的开发进程。