精子竞争压力下小鼠附睾成熟过程中精子运动性、染色质稳定性和DNA完整性的种间差异研究

《Biology of Reproduction》：Epididymal sperm maturation in mouse species with differing levels of sperm competition

本研究针对不同精子竞争强度的小鼠物种，系统揭示了附睾成熟过程中精子运动性获得、顶体重塑、染色质稳定性和DNA完整性的动态变化规律。研究人员通过比较三种近缘鼠种（Mus musculus、M. spretus和M. spicilegus）附睾不同区域（caput、corpus、cauda）和输精管的精子样本，发现精子竞争压力与精子成熟效率存在显著关联。研究证实高竞争物种（M. spretus和M. spicilegus）表现出更优的运动性获得模式和DNA完整性，为理解生殖进化适应机制提供了重要实验依据。

　　

在哺乳动物生殖生物学领域，精子在附睾中的成熟过程一直被视为决定受精成功率的关键环节。当精子离开睾丸时，它们还无法运动且不具备受精能力，必须经过附睾这个长达数米的管道时，才能获得运动性、完成顶体重塑和染色质稳定化等一系列重要变化。然而，这一复杂过程在不同物种间是否存在差异，以及这些差异是否与物种的生殖策略（特别是精子竞争强度）相关，仍是未解之谜。

以往的研究主要集中在单一物种（如实验室小鼠）的精子成熟过程，而对近缘物种的比较研究相对缺乏。三种小鼠物种——家鼠（Mus musculus）、阿尔及利亚小鼠（M. spretus）和堆建小鼠（M. spicilegus）——因其不同的交配系统而成为理想的研究模型。其中，M. spretus和M. spicilegus被认为经历较高程度的精子竞争（即多个雄性的精子在雌性生殖道内竞争受精机会），而M. musculus的精子竞争强度相对较低。这种差异可能驱动了精子形态和功能的适应性进化。

发表在《Biology of Reproduction》上的这项研究，由西班牙国家自然科学博物馆的Eduardo R.S. Roldan团队主导，首次系统比较了这三种小鼠在附睾成熟过程中精子多参数的变化规律。研究团队假设：高精子竞争物种的精子会在附睾成熟过程中表现出更高效的成熟模式，包括更早获得运动性、更稳定的染色质结构和更完整的DNA。

为验证这一假设，研究人员采用多学科技术手段，包括计算机辅助精子分析、荧光染色（Hoechst 33342、chromomycin A3）、精子染色质结构分析（SCSA）和核形态分析软件，对来自附睾不同区域（头、体、尾）和输精管的精子样本进行了全面评估。

研究方法上，研究团队从成年雄性小鼠（6-14个月大）采集了附睾不同区域和输精管的精子样本，使用改良的Tyrode溶液（mT-H）维持精子活力。通过相位对比显微镜评估精子运动参数（总运动力、前进运动力和运动质量），采用伊红-苯胺黑/吉姆萨染色评估精子活力。顶体状态通过形态学观察和图像分析软件（ImageJ）进行量化。染色质凝集状态通过CMA3染色评估，DNA碎片化通过SCSA分析测定，而核形态变化则通过专门的核形态分析软件（Nuclear Morphology Analysis）进行量化。

精子运动力和活力在附睾转运过程中的变化

研究结果显示，精子运动参数在附睾成熟过程中呈现显著的区域特异性变化。三种物种的精子总运动力和前进运动力均从附睾头向尾部逐渐增加，在附睾尾达到峰值。然而，物种间存在明显差异：M. spretus和M. spicilegus的精子在附睾头至体的过渡阶段就开始获得运动能力，而M. musculus的精子直到附睾体至尾的过渡阶段才显著增加运动力。更重要的是，M. musculus的精子在各区域的运动力参数均显著低于其他两种物种。运动质量（活力）评估也显示了类似的模式，M. spretus从附睾头到尾都表现出持续改善的运动质量。所有物种在各附睾区域均保持较高的精子存活率（约80-95%），但M. musculus的存活率相对较低。

头部在附睾转运过程中的变化

精子头部形态在附睾成熟过程中经历了显著重塑。研究人员根据顶体状态将精子分为三类：松散顶体（苍白、大区域）、紧凑顶体（暗色、小区域）和无顶体精子。形态计量学分析显示，从松散顶体向紧凑顶体转变时，精子头部面积减小，圆形度增加，表明头部变得更加流线型。沿附睾路径，松散顶体精子的比例从附睾头（65-90%）显著下降至附睾尾（3-10%），而紧凑顶体精子的比例相应增加。值得注意的是，M. musculus表现出最高的无顶体精子比例（在输精管中达约50%），这可能反映了其精子质量控制机制的相对松弛，与其较低的精子竞争水平一致。M. spicilegus展示了最快的顶体紧凑化进程，而M. spretus处于中间状态。

在雄性生殖道转运过程中核形状的变化

核形态分析揭示了物种间显著的差异，但附睾成熟过程中的变化相对较小。通过核形态分析软件生成的"角度轮廓"识别了四个核段，其中一些段在物种间显示长度差异，但在附睾转运过程中变化不显著。M. musculus具有最大的核面积、周长和长度相关参数，而M. spretus在宽度相关参数上值最高。M. spicilegus则表现出最高的椭圆度和伸长率。大多数核形态变化发生在附睾体区域，附睾尾部的变化较小。这些发现表明，虽然精子核的基本形态在精子形成结束时已基本确定，但附睾成熟过程中仍会发生细微但重要的形态调整。

附睾转运过程中的原核化

CMA3染色结果显示，染色质凝集状态在附睾成熟过程中显著改善。步骤15-16的圆形精子细胞显示极高的CMA3阳性率（89-96%，表明原核化不足），而在附睾头区域，完全CMA3阳性的精子比例急剧下降（27-47%）。从附睾体开始，CMA3阳性细胞比例进一步下降至非常低的水平（<3.7%），表明染色质凝集状态显著改善。部分CMA3阳性的精子也呈现类似的下隆趋势。三种物种在CMA3染色模式上没有显著差异，表明原核化过程在系统发育上相对保守。

附睾转运过程中的DNA碎片化

SCSA分析显示，DNA碎片化指数（tDFI和HDS）沿附睾路径显著下降。tDFI在附睾头最高，向尾部逐渐降低，表明DNA损伤精子比例减少。HDS（高DNA可染性，与组蛋白保留相关）也呈现类似模式，在附睾头至体的过渡阶段急剧下降。物种比较显示，M. spicilegus的tDFI值最高，而M. spretus的tDFI值最低，这与它们各自的精子竞争水平相一致。M. musculus的DNA碎片化水平介于两者之间。

原核化与DNA碎片化之间的相关性

相关性分析发现，当将所有物种和数据合并时，CMA3染色（原核化指标）与DNA碎片化指数（tDFI和HDS）之间存在显著正相关。在M. spretus中，附睾头和体的精子显示CMA3染色与DNA碎片化之间存在显著相关性，而其他两种物种的相关性较弱。这一发现支持了原核化在保护DNA完整性方面的重要作用，但也表明这种关系可能受物种特异性因素的影响。

研究结论与讨论部分强调，附睾成熟是一个复杂且高度协调的过程，涉及精子运动性、形态和染色质状态的多方面变化。本研究首次在进化框架下系统比较了近缘物种的精子成熟动力学，揭示了精子竞争压力可能塑造了附睾成熟过程的种间差异。

高精子竞争物种（M. spretus和M. spicilegus）表现出更优的精子成熟模式，包括更早的运动性获得、更稳定的顶体结构和更完整的DNA完整性。相比之下，低精子竞争物种（M. musculus）的精子成熟效率较低，表现为延迟的运动性获得、较高的顶体丢失率和中等水平的DNA碎片化。

这些差异可能反映了不同物种在生殖策略上的适应性进化。在高精子竞争环境中，选择压力可能倾向于更高效的精子成熟机制，以产生更具竞争力的精子群体。而在低竞争环境中，这种选择压力相对较弱，可能导致精子质量控制的松弛。

研究还证实了染色质凝集（原核化）与DNA保护之间的功能联系，支持了原核化在维持精子基因组完整性中的关键作用。附睾成熟过程中原核化状态的改善和DNA碎片化的减少，可能通过原核蛋白间二硫键的形成和氧化损伤防护机制的增强来实现。

这项研究不仅增进了我们对精子生物学基本过程的理解，也为男性不育症的诊断和治疗提供了新视角。许多特发性不育症可能与精子附睾成熟缺陷相关，本研究建立的多参数评估框架可为临床精子质量评估提供参考。此外，研究结果对辅助生殖技术的优化具有重要意义，特别是在精子选择和处理策略方面。

从进化生物学角度看，这项工作为理解性选择如何塑造精子性状提供了重要证据，支持了精子竞争作为驱动精子形态和功能进化的重要力量的理论框架。未来的研究可进一步探索附睾分泌物组分的种间差异，以及这些差异如何影响精子成熟过程和受精成功率。