靶向基因组安全港的位点特异性转座酶实现人细胞中基因大小DNA的高效无缺口插入

《Nucleic Acids Research》：Gene-sized DNA insertion at genomic safe harbors in human cells using a site-directed transposase

本研究针对基因治疗中基因大小DNA序列精准整合的难题，开发了INTACT系统。研究人员通过工程化改造MLT转座酶，突变其DNA结合域以减少脱靶，并利用可编程TALE蛋白引导转座至特定位点，最终在基因组安全港实现了>4 kb DNA的高效、精准插入，为基因治疗提供了新工具。

　　

实现基因的精准替换是基因治疗领域的圣杯。许多单基因遗传病由患者特异性的突变引起，使得个体化矫正变得不切实际，这凸显了通用型全基因替换策略的必要性。然而，现有的基因整合技术面临两大核心挑战：病毒载体整合位点不可控，存在插入突变和致癌风险；而基于CRISPR-Cas系统的同源定向修复效率低下，尤其在非分裂细胞中几乎不可行，且其依赖的双链断裂会引发染色体缺失、重排甚至染色体重碎等严重后果。有没有一种方法能够像“精准快递”一样，将完整的治疗基因安全、高效地投递到基因组的“安全港”，且不破坏基因组的稳定性？

发表在《Nucleic Acids Research》上的这项研究给出了肯定的答案。研究人员开发了一种名为INTACT的创新型系统，它巧妙地将一种源自蝙蝠的转座酶改造成为“位点导向”的分子机器，成功实现了基因大小DNA序列在人类基因组中的精准、高效整合，且完全避免了双链断裂。

为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术：他们利用AlphaFold2预测蛋白质结构以指导理性设计；构建了包含 excision assay（切除 assay）、integration assay（整合 assay）和plasmid-to-plasmid (P2P) reporter assay（质粒到质粒报告 assay）在内的多功能报告系统，用于高通量筛选和效率评估；采用droplet digital PCR (ddPCR)（微滴数字PCR）对基因组靶向插入进行精确定量；并通过self-reporting transposon (SRT) assay（自报告转座子 assay）在全基因组范围内分析转座酶的插入位点偏好性。此外，研究还涉及了分子克隆、细胞转染、流式细胞术、基因组PCR和Sanger测序等常规分子和细胞生物学技术。所有细胞实验均使用HEK293T细胞系。

Mutations in the native MLT DNA-binding domain reduce random genomic integration

研究人员首先对天然的MLT转座酶进行理性设计。他们利用AlphaFold2预测的结构，瞄准了推测与DNA相互作用的环区（I332-I338），通过突变其DNA结合域，旨在创造一类保留切割活性但整合能力受损的Exc⁺Int^-突变体。通过 excision assay 和 integration assay 的双重筛选，他们成功鉴定出多个符合条件的突变体，其中m1 (R333K, K334A, N335A, R336K, D416N) 突变体的随机整合效率降至接近背景水平，为后续的靶向整合奠定了基础。

Linking artificial DNA-binding proteins to MLT targets integration to plasmids in human cells

接着，研究团队尝试将人工DNA结合蛋白（如锌指蛋白E2C或TALE）与MLT突变体连接，以恢复其靶向整合能力。他们开发了P2P报告系统来评估靶向效率。该系统包含一个供体质粒（携带由启动子驱动的5'端EmGFP片段和剪接供体）和一个报告质粒（包含靶序列、剪接受体和3'端EmGFP片段）。当转座子精准插入报告质粒的靶位点附近时，通过剪接可恢复完整的EmGFP基因表达。研究发现，非共价连接策略（通过ALFA标签和纳米抗体NbALFA的相互作用）比直接融合效果更好，并且确定了DNA结合蛋白识别序列与TTAA插入位点之间的最佳间距（对于TALE约为18-20 bp）。同时，在TTAA两侧各放置一个结合位点（同源二聚或异源二聚）能显著提高靶向效率。

The target TTAA flanking sequence influences the insertion choice by Exc⁺Int^-mutants

在优化过程中，研究人员发现Exc⁺Int^-突变体对特定的八核苷酸序列（如taTTAAta和ttTTAAaa）有明显的插入偏好。这提示局部DNA的弯曲性可能影响整合效率。通过分析未修饰MLT的全基因组插入谱，他们验证了这些优选位点的普遍性，并据此选择基因组中的靶位点，以充分利用这种内在偏好性来提升INTACT的效率。

Covalent fusion of a TALE to MLT targets octanucleotide sites in the human genome

初步的基因组靶向尝试使用共价融合了TALE的MLT突变体（m2），靶向基因组中 flanking 序列相同的同源二聚位点。尽管检测到了靶向插入，但效率较低（最高约0.9% per cell）。研究还发现，靶位点的拷贝数（例如由于细胞系染色体非整倍性导致）会影响每个细胞的总体整合效率，靶向多拷贝位点可能获得更高的 per cell 整合率。

Noncovalent linkage of TALEs to MLT improves targeting efficiency to the human genome

为了进一步提高效率，研究团队采用了非共价连接策略，将ALFA标签插入MLT突变体（m2）的N端非结构化域（G66位点），而将结合ALFA标签的纳米抗体（NbALFA）融合到TALE的C端。这种灵活的连接方式可能允许转座酶在整合过程中进行必要的构象变化。应用此策略靶向同源二聚基因组位点（HoD4）时，效率比共价策略提高了9倍以上，达到8.9% per cell。

Heterodimeric TALEs mediate targeting to a genomic safe harbor

为了扩大可靶向的基因组位点范围，研究转向使用两种不同的TALE（异源二聚）来靶向单个基因座。他们选择了一个位于6号染色体上的基因组安全港位点，该位点满足安全港标准，且是MLT偏好的八核苷酸序列。使用针对其两侧不同序列的TALE NbALFA融合蛋白，INTACT系统在该位点实现了高达67.8% per cell的靶向整合效率，并通过基因组PCR和测序验证了插入的准确性。

Optimizations of INTACT enhance genome targeting

研究人员进行了一系列优化来最大化INTACT的效率。这包括：1) 靶向多拷贝的核糖体DNA（rDNA）位点，以增加可用靶点数量；2) 将NbALFA纳米抗体重新定位到TALE的N端，并设计TALE结合其识别序列的反向互补序列，将最佳间距调整至20 bp；3) 筛选出脱靶整合更低的Exc⁺Int^-突变体m12 (R333S, K334A, N335A, R336K, D416N)；4) 系统测试TALE识别序列的长度（9 bp, 11 bp等），发现对于rDNA1位点，下游12 bp和上游15 bp的TALE组合效果最佳；5) 优化转座酶 helper 质粒与 donor 质粒的转染比例。

High efficiency genome targeting to rDNA safe harbor sites

最终，通过整合上述所有优化策略（非共价连接、NbALFA在TALE N端、20 bp间距、m12突变体、靶向多拷贝rDNA1位点、使用12 bp/15 bp TALE、优化转染条件，并通过流式细胞分选富集转染细胞），INTACT系统在rDNA1位点实现了惊人的高效靶向整合。经ddPCR定量，平均每个细胞获得了1.2次靶向插入，这意味着大多数成功转染的细胞都至少有一次精准的整合事件。脱靶分析表明，m12突变体将非特异性整合事件抑制到了接近背景的水平。

本研究成功开发了INTACT系统，这是一种高效、精准的基因组编辑新平台。其核心创新在于通过对MLT转座酶的理性工程化改造，将其强大的DNA整合能力严格限制在由可编程DNA结合蛋白（如TALE）指定的基因组位点。该系统无需引入双链断裂，避免了由此带来的各种风险，并且通过突变转座酶自身的DNA结合域，将脱靶整合降至最低。靶向多拷贝rDNA位点所实现的高效率（平均1.2次靶向插入/细胞）展示了其巨大的临床应用潜力，特别是在需要高表达水平且安全性要求严格的基因治疗领域，如CAR-T细胞疗法或单基因遗传病的矫正。与需要多个组分的CRISPR相关转座酶（CAST）系统相比，INTACT仅需一个转座酶和两个DNA结合蛋白，体系更为简洁。这项研究为基因大小DNA序列的安全、高效、位点特异性整合提供了强大的新工具，极大地推动了基因治疗和合成生物学的发展。