多配置肝脏微生理系统模拟胆汁淤积性化学效应的潜力探索

《Archives of Toxicology》：Exploring the potential of liver microphysiological systems of varied configurations to model cholestatic chemical effects

本研究针对药物和化学物安全性评价中胆汁淤积型肝损伤预测的难题，研究人员系统比较了2D培养与三种肝脏微生理系统(MPS)中HepaRG细胞、原代人肝细胞(PHH)和人诱导多能干细胞来源肝细胞(iHeps)的功能差异。研究发现，在PhysioMimix LC12系统中，PHH和HepaRG能够稳定维持肝功能标志物(白蛋白、尿素、CYP3A4活性)达30天，且仅在该系统中能检测到三种胆汁淤积剂(波生坦、2-辛炔酸、α-萘基异氰酸酯)引起的胆汁酸分泌减少。该研究为体外肝脏模型的选择提供了重要依据，推动了微生理系统在药物安全性评价中的应用。

　　

在药物研发和化学物安全性评价领域，药物性肝损伤(DILI)始终是困扰科研人员和监管机构的重要难题。尽管候选药物在进入市场前都经过严格的临床前评价，但肝毒性问题仍然是药物上市后撤市和黑框警告的主要原因之一。特别值得关注的是，在各类DILI病例中，胆汁淤积型和混合型肝损伤占据了相当大比例(20-40%)，这使得开发能够准确预测胆汁淤积性肝损伤的体外模型显得尤为迫切。

传统的二维(2D)肝细胞培养模型虽然操作简便，但难以长期维持肝细胞的特异性功能，特别是胆汁酸代谢和转运相关功能，这限制了其在胆汁淤积研究中的应用。近年来兴起的微生理系统(MPS)技术通过模拟体内微环境，为肝细胞提供了更加生理相关的培养条件，有望解决这一难题。然而，面对多种可用的MPS平台和不同类型的肝细胞，研究人员该如何选择最适合研究胆汁淤积的模型系统呢？

为了回答这个问题，由Katharina S. Nitsche领衔的研究团队在《Archives of Toxicology》上发表了他们的最新研究成果。研究人员开展了一项系统性的比较研究，旨在评估不同配置的肝脏MPS在模拟胆汁淤积性化学效应方面的潜力。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究：使用三种肝脏微生理系统(PhysioMimix LC12、OrganoPlate 2-lane 96和3-lane 40)与传统2D培养进行比较；细胞来源包括商业化的HepaRG细胞、原代人肝细胞(PHH)和人诱导多能干细胞来源肝细胞(iHeps)；通过检测白蛋白分泌、尿素合成、CYP3A4酶活性和胆汁酸谱等指标评估肝细胞功能；利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对细胞培养基中的胆汁酸进行定量分析；使用三种已知的胆汁淤积剂(波生坦、2-辛炔酸、α-萘基异氰酸酯)进行模型验证。

不同细胞来源和模型的基底功能比较

研究发现，在2D培养和PhysioMimix LC12系统中，PHH和HepaRG细胞表现出相似的肝功能特征。在2D培养中，PHH的功能标志物与先前使用同一供体的研究结果一致，证明了实验的可重复性。HepaRG的功能在最初7天内与PHH相当，但在第二周出现白蛋白和尿素分泌下降，随后在第3-4周出现反弹，这种现象与之前报道的HepaRG球状体培养中的观察结果相似。iHeps的肝细胞标志物分泌和CYP3A4活性明显低于PHH和HepaRG，与先前报道一致。

在PhysioMimix LC12系统中，PHH和HepaRG的比较显示，两种细胞类型的白蛋白水平在最初7天培养中相似，随后HepaRG的水平下降但在培养第3周出现反弹。PHH的尿素产量在流体培养的最初几天比HepaRG高约10倍，但到第5天时两者水平趋于相等，且HepaRG细胞能维持尿素生产水平达30天。CYP3A4活性在最初一周内两种细胞类型相当，且在HepaRG中能稳定维持30天。

在OrganoPlate模型中，HepaRG和iHeps的功能普遍较低，无论是2通道还是3通道版本的OrganoPlate都是如此。这些结果与先前关于iHeps在OrganoPlate 2-lane 96中培养以及HepaRG在OrganoPlate 3-lane 40中培养的报道一致。

胆汁淤积剂波生坦的效果评估

当细胞在第5和6天接受处理，并在第7天评估生物标志物时，最显著的效果是PHH和HepaRG细胞在96孔板和PhysioMimix LC12中培养时，CYP3A4活性均增加。值得注意的是，虽然PHH和HepaRG在PhysioMimix LC12中培养时，培养结束时的CYP3A4基础活性远高于2D培养，但在两种模型和细胞类型中诱导都很显著，且2D中的诱导程度比MPS中高约2倍。在两种OrganoPlate模型中，无论是iHeps还是HepaRG都没有观察到这种对CYP3A4的影响。在2D或PhysioMimix LC12 MPS中没有观察到显著的细胞毒性或对白蛋白或尿素合成的影响。

在培养30天的HepaRG中，波生坦仅对CYP3A4诱导有影响；2D和PhysioMimix LC12中的反应与培养7天后观察到的反应几乎相同。

α-萘基异氰酸酯和2-辛炔酸的效果评估

在α-萘基异氰酸酯(ANIT)的实验中，观察到了与波生坦相似的效果——在没有细胞毒性或对肝细胞合成功能影响的情况下，CYP3A4显著诱导。CYP3A4诱导仅在2D和PhysioMimix中与PHH和HepaRG一起观察到，无论是在培养7天和30天后。在两种OrganoPlate模型中都没有看到这种效果。

2-辛炔酸(2-Oct)的研究结果显示，大多数生物标志物没有变化，只是在某些肝细胞和模型中CYP3A4活性有显著但轻微的下降。目前没有证据表明2-Oct诱导、抑制或被CYP3A4代谢。

胆汁酸分泌分析

在培养7天或30天结束时，对2D和PhysioMimix LC12 MPS中PHH和HepaRG细胞实验的细胞培养基中几种胆汁酸的浓度进行了测量。研究发现，培养7天后，2D培养的PHH中总胆汁酸水平最低，而PhysioMimix LC12培养的PHH中最高——相差27倍。HepaRG显示出中等水平的胆汁酸产量；PhysioMimix LC12中的水平高于2D，但差异不显著。

当比较化学处理对胆汁酸分泌的影响时，发现HepaRG和PHH都有显著效果，但仅在PhysioMimix LC12 MPS中。有趣的是，在PHH实验中，所有3种化合物都导致细胞培养基中胆汁酸浓度显著降低(约两倍)。相比之下，在HepaRG中，只有ANIT和2-Oct，而不是波生坦，产生了显著效果。当比较7天和30天的HepaRG细胞培养时，值得注意的是，在两个时间点，PhysioMimix LC12中的水平都高于2D，尽管只有7天的差异是显著的。培养基中的总胆汁酸水平在30天的培养过程中保持大致相同的水平。

研究结论与意义

本研究通过系统比较不同肝细胞来源和培养模型，为胆汁淤积性肝损伤的体外研究提供了重要见解。研究发现，原代人肝细胞(PHH)和HepaRG细胞在高级(PhysioMimix LC12 MPS)和常规(2D)条件下培养时，表现出相当的基底肝细胞功能，且明显优于iHeps。两种细胞类型都可用于检测和表征外源物引起的胆汁淤积风险，但PHH显示出比HepaRG更一致的反应。

特别重要的是，研究发现HepaRG细胞在PhysioMimix LC12 MPS中培养时能维持长达30天的功能，并能通过胆汁酸分泌减少对胆汁淤积化合物作出反应。总分泌胆汁酸水平和CYP3A4活性是检测肝损伤潜力的敏感且信息丰富的后期生物标志物。

这项研究的实际意义在于为研究人员选择合适的肝细胞模型和培养系统提供了明确指导。对于初步筛选和浓度-时间曲线评估，使用PHH或HepaRG的2D多孔板研究是合理的第一选择模型。然后可以在如PhysioMimix LC12这样的流动系统中测试选定浓度，以确认发现并获得更大的生理相关性。

从更广阔的视角来看，这项研究推动了下一代体外肝脏模型作为监管科学预测工具的应用。随着代谢相关脂肪肝病(MAFLD)发病率的全球性增加，以及可能与饮食、生活方式和慢性低水平暴露于各种化学物相关的关联，能够用于研究可能导致胆汁淤积的化学物的体外肝脏模型需求日益增长。本研究建立的模型系统和方法为这一重要领域的研究提供了有力工具。

当然，这项研究也存在一些局限性，如依赖商业来源、预先分化的细胞来源意味着个体间变异性未在研究中得到体现；虽然测试了短期和延长培养时间，但一些终点如白蛋白和胆汁酸分泌显示出时间波动，可能混淆长期毒性或适应性的解释；仅研究了少数几种特征明确的胆汁淤积剂等。这些局限性为未来研究提供了方向。

总体而言，这项研究通过全面评估不同肝细胞来源和培养系统在胆汁淤积研究中的表现，为药物和化学物安全性评价提供了重要科学依据，推动了微生理系统在毒理学研究中的实际应用，对保障药物安全和公共卫生具有重要意义。