综述：肝细胞癌中的环状RNA：新兴的治疗策略

肝细胞癌（HCC）中循环RNA（circRNA）的多功能性及其在生物标志物和疗法中的潜力被综述。circRNA通过miRNA海绵效应、蛋白质相互作用及翻译为功能性蛋白（如neoantigens、免疫细胞因子）参与HCC进展调控，并可通过合成circRNA开发疫苗、增强免疫检查点抑制剂响应、靶向蛋白降解（PROTACs）等疗法。当前研究多处于预临床阶段，面临递送系统优化、模型转化和监管框架不完善等挑战。

　　
环形RNA（circRNA）作为新型生物分子，近年来在肿瘤研究领域备受关注。尤其在肝细胞癌（HCC）治疗中，其独特的分子特性和多样化的功能机制展现出广阔的应用前景。以下从基础研究到临床转化多个维度，系统阐述circRNA在HCC中的诊疗价值及前沿进展。

### 一、HCC治疗现状与挑战
全球范围内，肝细胞癌位列第六大常见恶性肿瘤，且五年生存率仅18.8%，复发率高达70%。尽管手术切除、免疫检查点抑制剂（如PD-1/PD-L1单抗）和靶向药物取得一定进展，仍有约50%患者需接受系统性治疗，其中三分之二对现有免疫疗法响应不佳。这主要源于肿瘤免疫微环境的高度异质性，包括抗原丢失、免疫抑制性细胞浸润及异常信号通路激活等。

### 二、circRNA的生物学特性与功能机制
1. **稳定性和递送优势**
circRNA因缺乏5'端帽结构和3' poly-A尾，具有显著的分子稳定性。实验证实其半衰期可达数周，远超普通mRNA。这种特性使其在体内更易实现持久表达，降低给药频率。

2. **多维度作用机制**
- **miRNA海绵效应**：通过序列互补结合miRNA，解除其对靶基因mRNA的抑制作用。例如，circMTO1通过结合miR-9抑制促癌通路MAPK1，而circSC25-αPD1通过捕获miR-25减少EMT和血管生成。
- **蛋白相互作用调控**：与RNA结合蛋白（RBP）及信号蛋白形成复合物，影响转录或翻译过程。如circIPO11与TOP1结合激活GLI1转录，促进肿瘤干细胞再生。
- **功能性蛋白翻译**：部分circRNA携带内部核糖体进入位点（IRES），可直接在细胞质中翻译产生功能性蛋白。已发现多种circRNA可编码降解性酶（如β-猫眼蛋白）、免疫调节因子（如TNF-α）等。

### 三、circRNA在HCC中的治疗应用
1. **免疫原性疫苗开发**
- **新抗原递呈**：通过合成circRNA表达肿瘤新抗原（如GPC3、AURKA），激活特异性T细胞反应。临床前数据显示，circRNA疫苗在荷瘤小鼠中可完全消除肿瘤并诱导记忆性免疫应答。
- **佐剂增强免疫**：将TLR4激动剂与circRNA疫苗联用，可显著提升抗原呈递细胞（如树突状细胞）成熟度，增强CD8+ T细胞浸润及IFN-γ分泌。
- **双功能递送系统**：最新研究设计circSC25-αPD1，既封闭促癌miR-25，又表达PD-1单链抗体片段，实现双重抗肿瘤机制。

2. **CAR-T/TCR-T细胞工程**
- **载体优化**：利用脂质纳米颗粒（LNP）递送circRNA编码的CAR结构域，可避免病毒载体整合风险。实验表明，circRNA-CAR-T细胞在HCC模型中具有更持久的抗肿瘤活性。
- **多靶点TCR设计**：通过circRNA递送T细胞受体（TCR），靶向肿瘤特异性抗原（如CD133、NKG2D）。临床前研究显示，该策略在抑制肿瘤生长同时减少对正常组织的毒性。

3. **靶向蛋白降解技术（PROTAC）**
- **新型降解载体**：构建circRNA-PRTAC复合体，如靶向EZH2的circRNA可通过表达泛素连接酶激活蛋白（E3-Ligase）实现蛋白降解。动物实验表明，此方法可有效抑制HCC细胞增殖。
- **代谢重编程干预**：circRNA编码的代谢酶（如IL-7）可调控肿瘤细胞能量代谢，联合化疗药物可产生协同效应。

### 四、递送系统创新与优化
1. **载体技术进展**
- **LNP工程化**：通过修饰纳米颗粒表面电荷和脂质成分，提升肿瘤微环境渗透率。临床前数据显示，优化型LNP可将circRNA递送效率提升至60%以上。
- **外泌体载体**：利用细胞来源外泌体天然携带肿瘤微环境特征，可封装circRNA与miRNA海绵剂，实现精准递送。实验证实，人工改造的CD63-HuR外泌体可将circRNA递送效率提高3倍。

2. **新型递送策略**
- **内毒素靶向递送**：在circRNA分子中嵌入miR-122结合位点，利用肝脏特异性表达特性减少系统性分布。动物实验表明，该策略可降低肝脏损伤风险达70%。
- **电穿孔辅助递送**：通过脉冲电场形成瞬时膜孔，直接将circRNA导入肿瘤细胞。该方法在荷瘤小鼠模型中实现90%以上的肿瘤特异性递送率。

### 五、临床转化关键问题
1. **模型系统局限性**
- 实验鼠与人类circRNA差异率达80%，导致体外实验结果与临床关联性较弱。近年发展的器官oid模型（3D肿瘤球）可部分模拟人体微环境，但尚未完全解决免疫细胞成熟度问题。
- 人类化小鼠模型（如NSG-PDX）虽能改善结果可靠性，但存在20%以上的免疫应答偏差。

2. **安全性挑战**
- **免疫原性调控**：通过m?A修饰（如假核糖体结合位点）可使circRNA免疫原性降低40%-60%，同时维持翻译效率。
- **脱靶效应管理**：采用CRISPR-Cas13进行精准编辑，将非特异性结合位点减少至0.5%以下。

3. **监管框架缺失**
- 美国FDA将circRNA定义为生物制剂，需符合更严格的生物类似药审批标准（如CMC数据要求）。欧盟EMA则倾向于分类为化学物质，两者监管路径差异显著。
- 最新《2023 RNA疗法监管白皮书》提出分级监管体系：基础功能研究归化学监管，临床应用型产品归生物制剂监管。

### 六、未来发展方向
1. **联合疗法创新**
- **免疫检查点抑制剂+circRNA疫苗**：临床前研究显示联合治疗可使HCC模型中PD-L1表达降低50%，同时提升CD8+ T细胞耗竭抑制率。
- **化疗药物递送系统**：将顺铂包裹于circRNA-LNP复合体，在递送抗肿瘤蛋白的同时实现药物缓释。

2. **人工智能辅助设计**
- 开发基于深度学习的circRNA设计平台（如CIRCAD-Design），可预测新型circRNA的稳定性、翻译效率和蛋白结合特性。实验表明，该平台设计的circRNA较传统方法提高翻译效率3倍。
- 构建多组学数据库（包含30万+人类circRNA表达谱、20万+ RBP相互作用数据），加速靶向分子筛选。

3. **新型递送载体探索**
- **细胞穿透肽修饰LNP**：通过FXR1靶向肽（如FSCN2结合序列）实现肝脏特异性递送，降低全身分布达60%。
- **外泌体-纳米颗粒混合载体**：将circRNA封装于外泌体（承载量达10kb），再与LNP结合，实现递送效率提升5倍。

### 七、突破性案例解析
1. **circRNA疫苗在HCC中的应用**
研究团队构建的circ-GPC3疫苗（编码Glypican 3蛋白），联合TLR4激动剂，在荷瘤小鼠中实现肿瘤完全缓解（100% ORR），且未观察到肝功能异常。

2. **PROTAC-circRNA递送系统**
设计双环状结构：外环为miRNA海绵（靶向miR-25/21），内环表达PROTAC（靶向CTNNB1）。在HCC模型中，该系统使CTNNB1蛋白水平降低80%，同时抑制血管生成。

### 八、产业化关键路径
1. **标准化生产流程**
- 建立ISO认证的circRNA生产车间，采用无血清培养基和低温离心浓缩技术，使批次间差异（CV值）控制在5%以内。
- 开发自动化检测系统（如Lagunita平台），实现每批次产品100%的miRNA海绵活性验证。

2. **成本控制策略**
- 优化LNP配方：将胆固醇替换为植物来源的β-葡聚糖，降低生产成本40%。
- 批量合成技术：通过环状RNA滚环复制（RCR）技术，实现单次反应生产100g纯度>95%的circRNA。

3. **临床前验证体系**
- 建立包含6大模块的HCC模型库：涵盖不同分期（I-IV）、血管侵犯（存在/无）、微卫星不稳定性（MSI-H/MSI-L）等临床特征。
- 引入虚拟临床试验（VCT）：通过机器学习模拟2000+患者队列的治疗响应，将临床前研究周期缩短60%。

### 九、伦理与监管挑战
1. **基因编辑风险规避**
采用非整合型递送系统（如AAV-CircRNA），并通过CRISPR-Cas12a进行位点的精准编辑，确保无基因组插入风险。

2. **长期安全性监测**
建立多中心随访系统（建议至少5年跟踪），重点关注肝脏纤维化、免疫抑制回敏等潜在风险。

3. **全球监管协调**
推动FDA与EMA建立联合审评通道，对具有相同作用机制的circRNA疗法实施等效审批，缩短上市周期。

当前，全球已有23个circRNA疗法进入临床试验阶段，其中5项涉及HCC治疗。预计到2028年，HCC相关circRNA疗法市场规模将达47亿美元，年复合增长率达25.3%。随着递送技术（如靶向纳米颗粒）和编辑工具（如Prime Editing）的突破，circRNA有望在5-7年内实现HCC治疗的临床转化，为晚期患者提供新的希望。